[發明專利]一種可溶性重組特立帕肽的非變性純化方法及應用

在審

• 申請號: 202011544114.4
• 申請日: 2020-12-23
• 公開（公告）號: CN112625117A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 余傳信;楊建良;劉曉龍;丁鐵林;梅叢進;董盼盼;沈孝森;何軍山
• 申請（專利權）人: 無錫和邦生物科技有限公司;江蘇省血吸蟲病防治研究所
• 主分類號: C07K14/635
• 分類號: C07K14/635;C12P21/06;C07K1/22;C07K1/20;C07K1/14;A61K38/29;A61P19/10;A61P19/08
• 代理公司: 蘇州國誠專利代理有限公司 32293
• 代理人: 王會

本發明公開了一種可溶性重組特立帕肽的非變性純化方法及應用，包括以下步驟：1)菌體裂解；2)鎳柱親和純化；3)酶切；4)鎳柱穿透；5)C18?100A柱純化；6)C18?300A反向色譜純化；7)旋蒸與凍干。本發明提供的可溶性重組特立帕肽的非變性純化方法及應用，采用鎳親和層析法從表達產物中分離Trx?hPTH(1?34)融合蛋白，再用酶切將重組特立帕肽從Trx?hPTH(1?34)融合蛋白中釋放出來，通過三步層析方法制備純化的重組特立帕肽，簡化了純化過程，提高了可溶性重組特立帕肽的純化效率與純度，對制備治療骨質疏松癥和骨折患者藥物的原料藥重組特立帕肽有重要幫助。

技術領域

本發明屬于生物技術與制藥工程技術領域，具體涉及一種重組特立帕肽的非變性純化 方法及應用。

背景技術

人甲狀旁腺素(Human Parathyroid Hormone,hPTH)是調節血液中鈣磷代謝的主要激 素，由甲狀旁腺主細胞分泌，是一種由84個氨基酸組成的多肽，它可與甲狀旁腺素受體 結合，對骨代謝發揮雙向作用。hPTH受體屬于G蛋白偶聯受體超家族，受體分為I型和 II型。hPTH-I受體主要分布于骨骼及腎，hPTH-II受體分布于腦和胰腺。甲狀旁腺素的N 端肽鏈與hPTH-I受體結合發揮促進骨細胞生長的作用，而C端肽鏈與hPTH-II受體結合， 可發揮促進骨細胞凋亡的作用。

人甲狀旁腺素1-34肽(hPTH1-34)，又稱特立帕肽，是甲狀旁腺素在人體內代射的天 然降解產物，由人內源性甲狀旁腺素N端的1-34位氨基酸組成。與天然完整的由84個氨基酸組成的hPTH分子相比，特立帕肽保留了完整hPTH促成骨細胞生長的作用，去掉了 促進骨細胞凋亡作用。因此，特立帕肽及其類似物是開發能有效治療骨質疏松、骨折藥物 的潛在候選靶分子，具有廣闊的臨床應用前景。

由于特立帕肽是一個小分子短肽，不含二硫腱，采用基因工程原核重組表達法進行制 備具有生產規模大、生產成本低、生產周期短等明顯優勢，是特立帕肽制備最常用方法之 一。由于甲狀旁腺素是一個真核細胞分子，在大腸桿菌中進行表達易形成包涵體，需要采 用變性條件先將含特立帕肽的包涵體進行變性溶解，然后在變性條件下通過層析方法進行 純化和復性。目前，最常用的重組特立帕肽純化方法多為變性條件的包涵體純化方法。由 于變性條件包涵體純化方法需要使用大量的變性劑，如尿素、鹽酸胍等，不僅存在生產成 本高、生產周期長、易造成環境污染的缺點，而且生產出來的重組特立帕肽的產量低、純 度差，不能滿足大規模商業化生產的需要。因此，迫切需要開發以可溶性表達的重組特立 帕肽為主的工程菌及發酵、純化工藝，以提高重組特立帕肽的生產效率。

為解決現有技術以包涵體形式表達重組特立帕肽的純化困難問題，申請人構建了一種 將甲狀旁腺素1-34肽與硫氧還蛋白進行融合表達的工程菌pET28b-Trx-hPTH(1-34)/E.coli BL21(DE3)，該菌株經過特定的發酵工藝發酵可獲得高可溶性表達水平的硫氧還蛋白甲 狀旁腺素1-34肽融合蛋白[Trx-hPTH(1-34)]的發酵產物，本發明在此基礎上發明了一種 可溶性重組特立帕肽的非變性純化方法，可以在非變性條件下將重組特立帕肽從Trx-hPTH (1-34)融合蛋白中完整地釋放出來，并能有效去除重組表達的特立帕肽中的雜質，獲得 的重組特立帕肽純度可以達至99％以上，從而提高重組特立帕肽的生產效率，為商業化特 立帕肽原料藥的生產創造了條件。

發明內容

為解決現有技術中以包涵體形式純化重組特立帕肽的方法中存在的技術問題，本發明 的目的在于提供一種重組特立帕肽的非變性純化方法及應用。

為實現上述目的，達到上述技術效果，本發明采用的技術方案為：

一種可溶性重組特立帕肽的非變性純化方法，包括以下步驟：

1)菌體發酵、裂解、離心：將發酵的表達Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的發酵細菌菌體進行裂解，離心，收集裂解產物上清液；