[發明專利]一種可溶性重組特立帕肽的非變性純化方法及應用

在審

• 申請號: 202011544114.4
• 申請日: 2020-12-23
• 公開（公告）號: CN112625117A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 余傳信;楊建良;劉曉龍;丁鐵林;梅叢進;董盼盼;沈孝森;何軍山
• 申請（專利權）人: 無錫和邦生物科技有限公司;江蘇省血吸蟲病防治研究所
• 主分類號: C07K14/635
• 分類號: C07K14/635;C12P21/06;C07K1/22;C07K1/20;C07K1/14;A61K38/29;A61P19/10;A61P19/08
• 代理公司: 蘇州國誠專利代理有限公司 32293
• 代理人: 王會

1.一種可溶性重組特立帕肽的非變性純化方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)菌體發酵、裂解、離心：將發酵的表達Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的發酵細菌菌體進行裂解，離心，收集裂解產物上清液；

2)鎳柱親和純化：將步驟1)所得樣品上鎳親和層析柱，洗脫結合在鎳親和層析柱上的Trx-hPTH(1-34)融合蛋白，得到親和純化的Trx-hPTH(1-34)融合蛋白；

3)酶切：使用腸激酶對步驟2)所得Trx-hPTH(1-34)融合蛋白進行切割，使得重組特立帕肽從融合蛋白中釋放下來；Trx-hPTH(1-34)融合蛋白經過切割后產生兩個肽段：Trx部分肽段和重組特立帕肽hPTH(1-34)；

4)鎳柱穿透：將步驟3)所得酶切產物上一個新的鎳親和層析柱，帶有6×His標簽的Trx部分肽段結合在鎳親和層析柱上，重組特立帕肽穿過鎳親和層析柱，收集穿透峰，得到初步純化的重組特立帕肽；

5)C18-100A柱純化：將步驟4)所得重組特立帕肽樣品上C18-100A柱，用乙腈進行梯度洗脫，獲得90％以上純度的重組特立帕肽hPTH(1-34)；

6)C18-300A反向色譜純化：取步驟5)C18-100A柱純化的重組特立帕肽蛋白樣品上C18-300A反向色譜柱，用乙腈進行梯度洗脫，獲得99％以上純度的重組特立帕肽；

7)旋蒸與凍干：將步驟7)所得樣品進行加溫，負壓旋蒸，去除殘留乙腈，然后進行真空冷凍干燥。

2.根據權利要求1所述的一種可溶性重組特立帕肽的非變性純化方法，其特征在于，步驟1)中菌體裂解的步驟為：將發酵細菌菌體與柱平衡緩沖液混合、重懸，隨后在冰浴條件下剪切、超聲裂解，離心后收集裂解產物上清液，過濾；所述柱平衡緩沖液的組分包括：25mMTris-HCl和1-10mM咪唑，柱平衡緩沖液的pH值為7-9。

3.根據權利要求1所述的一種可溶性重組特立帕肽的非變性純化方法，其特征在于，步驟2)中鎳柱親和純化的步驟為：將步驟1)所得樣品上鎳親和層析柱，步驟1)所得樣品與層析膠的體積比為1:1-2，上柱結束后先以柱平衡緩沖液洗柱，柱平衡緩沖液體積為鎳親和層析柱柱床體積的2-3倍，以去除未與層析膠結合的雜蛋白，再用洗脫緩沖液洗脫Trx-hPTH(1-34)融合蛋白，收集洗脫峰，得到親和純化的Trx-hPTH(1-34)融合蛋白，所述洗脫緩沖液的組分包括：50mM醋酸鈉和0.5M NaCl，洗脫緩沖液的pH為2-6。

4.根據權利要求1所述的一種可溶性重組特立帕肽的非變性純化方法，其特征在于，步驟3)中酶切步驟為：將步驟2)所得Trx-hPTH(1-34)融合蛋白溶液與10×酶切緩沖液按體積比10：1的比例進行混合，調節溶液的pH值至6-8，隨后加入腸激酶，于4-37℃條件下孵育3-24h后進行酶切，每1IU腸激酶對應加入0.2-2mg Trx-hPTH(1-34)融合蛋白。

5.根據權利要求1所述的一種可溶性重組特立帕肽的非變性純化方法，其特征在于，步驟4)中，鎳親和層析柱的鎳親和膠與步驟3)所得酶切產物的質量比為1000：20-60；通過洗柱液洗柱，用于沖洗非特異吸附的特立帕肽；所述洗柱液的組成包括：20mM Tris和10-40mM咪唑，pH 8.0。

6.根據權利要求1所述的一種可溶性重組特立帕肽的非變性純化方法，其特征在于，步驟5)中C18-100A柱純化的步驟為：用2M醋酸鈉、乙腈和去離子水來調節步驟4)獲得的初步純化的重組特立帕肽溶液，使醋酸鈉的終濃度達到50mM、乙腈濃度達至5％，調節溶液pH值為5.5-6.5；裝C18-100A柱，層析膠與樣品的質量比為100:0.5-1.0；以10％濃度的乙腈洗柱，再以含50mM NaAc和10％乙腈的平衡液平衡柱；將初步純化的特立帕肽溶液上C18-100A柱，上樣結束再以5個柱體積平衡液洗柱，然后用100％乙腈進行梯度洗脫，洗脫梯度15％逐步增加到35％，收集各洗脫峰，進行SDS-PAGE分析和有關物質含量分析。