[發(fā)明專利]一種多酚類物質(zhì)脫除杏仁過敏原測定實驗方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202011539372.3
• 申請日: 2020-12-23
• 公開（公告）號: CN112630176A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張愛琳;楊薇;張華;梁筱研;遲越;苗穎
• 申請（專利權(quán)）人: 天津農(nóng)學(xué)院
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N27/447;G01N15/02;G01N27/26
• 代理公司: 北京化育知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11833
• 代理人: 涂琪順

1.一種多酚類物質(zhì)脫除杏仁過敏原測定實驗方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1：準(zhǔn)備材料：Folin-Ciocalteu試劑、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、考馬斯亮藍(lán)染液、蛋白預(yù)染Marker、β-巰基乙醇、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉SDS、甘氨酸、POM汁、BB汁、CG汁；

步驟2：沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確移取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000mg/L)2.5、5.0、10.0、15.0、20.0至50.0mL容量瓶中，分別配制成質(zhì)量濃度為50、100、200、300、400mg/L的溶液，然后加入5.0mL質(zhì)量濃度為40％的Folin-Ciocalteu試劑，反應(yīng)8min后分別加入4.0mL7.5％Na₂CO₃溶液，再用去離子水定容至10ml，分別于30℃下反應(yīng)1.0h，測定提取液在760nm處的吸光值；

步驟3：總酚的測定

使用Folin-Ciocalteu比色法測定POM汁、BB汁和CG汁的總酚量，并表示為每升毫克沒食子酸當(dāng)量，為制備樣品，將稀釋的500μLPOM汁、BB汁、CG汁和2.5mL稀釋的Folin-Ciocalteu試劑在室溫下混合8min，隨后加入1.5mL的7.5％Na₂CO₃，在暗處培育2小時后，使用紫外可見分光光度計測量樣品在760nm處的吸光度；

步驟4：SDS-PAGE電泳；

步驟5：納米粒度和Zeta電位儀分析。

2.如權(quán)利要求1所述的多酚類物質(zhì)脫除杏仁過敏原測定實驗方法，其特征在于，步驟4包括如下步驟：

(1)樣品處理：多酚與杏仁提取物的相互作用通過SDS-PAGE電泳進(jìn)行評估；

(2)上樣：一般加樣體積為10-15μL，一個孔中加一個樣品，同時用已知蛋白分子量的蛋白mark作為對照，一般mark的上樣量為3μl；

(3)電泳：連接電泳儀，開啟電源，電壓調(diào)制80V，30min后，等到染料進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)制為120V，40-60min，直到染料到達(dá)分離膠底部距離下緣1cm左右時，停止電泳；

(4)切膠：取下凝膠板，去除濃縮膠，對照mark的分子量，將分離膠切成合適大?。?/p>

(5)考馬斯亮藍(lán)染色：將凝膠放入燒杯中，加入超純水煮沸棄液；配制染液然后加入燒杯中，煮沸4-5min后棄液；

(6)脫色：配制染色液，將染色液倒入燒杯中，煮沸棄液，重復(fù)操作，直至凝膠背景清晰可見；

(7)成像：用凝膠成像儀拍照保存。

3.如權(quán)利要求2所述的多酚類物質(zhì)脫除杏仁過敏原測定實驗方法，其特征在于，為了制備多酚-杏仁提取物復(fù)合物，將1mL(2mg/L)杏仁提取物與9mL不同濃度的POM汁、BB汁、CG汁在室溫下混合15分鐘，然后將混合物以10000r/min離心5分鐘，收集上清液按照4:1:1的比例，將40μL的杏仁復(fù)合物、10μL的蛋白上樣緩沖液(5X)和10μL的β-巰基乙醇進(jìn)行混合，放入離心管中，再將離心管用漂子固定放入已經(jīng)沸騰的水浴鍋中，煮沸變性，待10min之后取出，立即放入冰水中。

4.如權(quán)利要求3所述的多酚類物質(zhì)脫除杏仁過敏原測定實驗方法，其特征在于，不同濃度為不稀釋、3倍稀釋、9倍稀釋三種濃度。

5.如權(quán)利要求2所述的多酚類物質(zhì)脫除杏仁過敏原測定實驗方法，其特征在于，考馬斯亮藍(lán)染色中配制的染液材料為250mL乙醇+1.5mL考馬斯亮藍(lán)R-250+10％醋酸。

6.如權(quán)利要求2所述的多酚類物質(zhì)脫除杏仁過敏原測定實驗方法，其特征在于，脫色中配制的染色液材料為250mL乙醇+75mL冰乙醇，純水定容到1000mL。

7.如權(quán)利要求1所述的多酚類物質(zhì)脫除杏仁過敏原測定實驗方法，其特征在于，步驟5包括如下步驟：

(1)樣品處理：將1mL(2mg/L)杏仁提取物與9mL的POM汁、BB汁、CG汁在室溫下混合15分鐘，然后將混合物轉(zhuǎn)移到聚苯乙烯比色皿中進(jìn)行分析；

(2)打開軟件，選擇菜單測量，出現(xiàn)手動測量設(shè)置對話框；

(3)在測量類型下選擇大小；

(4)在樣品中輸入樣品信息及注解，為后續(xù)圖做說明；

(5)一般選擇權(quán)選擇默認(rèn)設(shè)置；

(6)溫度設(shè)定溫度為25℃，平衡時間設(shè)置為2分鐘；

(7)探測角測量，一般保持默認(rèn)ZS90選擇90度；

(8)測量持續(xù)時間-選擇自動；

(9)測量次數(shù)，選擇測量次數(shù)為3次；

(10)數(shù)據(jù)處理-選擇一般用途；

(11)點擊起點開始運(yùn)行。