[發明專利]一種基于莖環法的多重熒光定量PCR檢測非編碼小RNA的引物組

有效

• 申請號: 202011534669.0
• 申請日: 2020-12-22
• 公開（公告）號: CN113005181B
• 公開（公告）日: 2022-01-18
• 發明（設計）人: 周其偉;王軍;劉剛
• 申請（專利權）人: 廣州血康陸道培生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 段卉

本發明公開了一種基于莖環法的多重熒光定量PCR檢測非編碼小RNA的引物組，所述。本發明建立了一種基于莖環法的多重熒光定量PCR檢測非編碼小RNA方法，實現了1對上下游通用引物同時對多個靶標的逆轉錄產物的PCR擴增。在逆轉錄過程中加入了逆轉錄延伸引物，可以延長逆轉錄產物，由于增加了擴增產物的長度，可以大大方便上游引物和探針的設計；可將多個靶miRNA在單管反應中進行逆轉錄，然后再進行多重熒光定量PCR檢測，實現基于莖環逆轉錄引物的的miRNA的多重檢測，操作更加簡便、更加符合多個靶標miRNA聯合表達分析的臨床診斷應用需求。

技術領域

本發明涉及熒光定量PCR技術領域，更具體地，涉及一種基于莖環法的多重熒光定量PCR檢測非編碼小RNA的引物組。

背景技術

MicroRNA，即miRNA是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。研究表明，miRNA參與疾病發生、發展。因此miRNA的表達差異的檢測能為疾病的篩查、診斷提供思路，從而實現miRNA在臨床診斷的應用。一般認為使用單一miRNA靶標的表達變化難以實現對疾病的有效診斷。聯合多個miRNA靶標，參照內參均一化、定量檢測，才能有效實現miRNA在臨床診斷上的應用。此外，臨床診斷的操作方法一般減少人工操作步驟，減少操作誤差，以實現簡便高效。

目前，miRNA的檢測方法主要分為不需要樣本擴增的探針直接雜交方法和基擴增的方法，例如：Norhthern blotting法、微陣列法、克隆和測序法、實時熒光定量PCR法等。

其中，實時熒光定量PCR檢測miRNA方法同時具備靈敏度高、特異性強、簡便快速、成本低等多種優點，是實現miRNA的定量檢測最常見方法。目前，實時熒光定量PCR檢測包括根據逆轉錄方法的不同分為加尾法RT-PCR(Tailing Reaction RT-PCR)和莖環法RT-PCR(Stem-loop RT-PCR)兩種主要方法。無論加尾法RT-PCR或莖環法RT-PCR，逆轉錄、定量檢測一般是分步操作，操作更為繁瑣，人工移液等操作也會在增加實驗誤差。盡管莖環法RT-PCR的操作相對簡便，檢測單個miRNA也最為精準，但是基本上很難實現多重檢測。而且，由于莖環逆轉錄引物的3’端為特異性序列，原理上要實現多重檢測則需要針對不同的靶標miRNA設計莖環逆轉錄引物上的特異性結合序列，這樣成本會增加，且特異性結合序列的長短、堿基差異也會導致逆轉錄效率的偏差。因此，莖環法RT-qPCR不適宜靶標miRNA較多情況下的多重檢測。

當靶標miRNA數量適宜時，通過莖環法設計則既可以兼顧莖環法高特異性、精確性的特點，又能實現多個靶標miRNA有效多重檢測的需求。基于此，專利CN201510639411公開了一種基于莖環法RT-PCR開發miRNA多重檢測方法，此方法包括逆轉錄、單鏈互補延伸、S1核酸酶消化、固相吸附提取和熒光定量檢測步驟，但是其步驟繁瑣，組分更為復雜。本發明同專利CN201510639411相比具有以下優點：①在技術原理上完全不同，本發明只需在逆轉錄過程中加入逆轉錄延伸引物，然后通過逆轉錄反應即可獲得所需長片段cDNA，而專利CN201510639411則是通過逆轉錄獲得cDNA后，再進行單鏈互補延伸才能獲得所需的產物。②本發明操作簡單、過程簡單，無需進行單鏈互補延伸、S1核酸酶消化、固相吸附提取等步驟。③專利CN201510639411使用的逆轉錄引物為線性結構，而本發明所用逆轉錄引物為典型的莖環結構，可以提高逆轉錄反應的特異性。④本發明成本低廉，無需核酸酶消化、固相吸附提取等試劑，可大大降低使用成本。

本發明在技術上有一定的創新性，可以對樣本中的非編碼小RNA基因準確地進行檢測，為miRNA的的熒光定量檢測提供操作更為簡便的、成本相對低廉的準確、靈敏的的多重檢測方法。

發明內容

本發明基于現有技術的不足，提供一種基于莖環法的多重熒光定量PCR檢測非編碼小RNA的引物組。本發明可以單管PCR管中實現逆轉錄和熒光定量檢測。基于成熟的非編碼小RNA的長度、結構等一致特點，本發明適用于包括miRNA在內的，各種成熟的非編碼小RNA檢測，如piRNA、siRNA等。