[發(fā)明專利]一種基于液相探針捕獲的Y染色體測(cè)序方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011530843.4
• 申請(qǐng)日: 2020-12-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112522382A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 文少卿;王凌翔;徐旭鼎;雷波
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州深曉基因科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869;C12N15/10
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 趙崇楊

一種基于液相探針捕獲的Y染色體測(cè)序方法，包括如下步驟：S1.提取基因組DNA并片段化；S2.對(duì)片段化的DNA進(jìn)行末端修復(fù)；S3.在DNA片段兩端加上測(cè)序接頭并純化連接產(chǎn)物；S4.PCR擴(kuò)增連有接頭的片段DNA進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增并純化；S5.文庫(kù)質(zhì)量控制；S6.探針區(qū)域的挑選及優(yōu)化，并設(shè)計(jì)局部密集式探針；S7.將DNA文庫(kù)和探針進(jìn)行文庫(kù)雜交反應(yīng)，捕獲目標(biāo)DNA片段；S8.將捕獲的目標(biāo)DNA片段進(jìn)行分離；S9.對(duì)分離后的目標(biāo)DNA片段進(jìn)行高通量測(cè)序。本發(fā)明利用液相探針捕獲技術(shù)，通過(guò)對(duì)探針區(qū)域進(jìn)行挑選與優(yōu)化，對(duì)Y染色體的測(cè)序長(zhǎng)度更長(zhǎng)，就能夠測(cè)試到更多的突變，實(shí)現(xiàn)了人類Y染色體20M區(qū)域的捕獲測(cè)序。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種基于液相探針捕獲的Y染色體測(cè)序方法。

背景技術(shù)

Y染色體為男性特有，具有父系遺傳的特點(diǎn)。Y染色體特異性區(qū)(非重組區(qū))由于不會(huì)和X染色體發(fā)生重組，所以呈現(xiàn)出穩(wěn)定的單倍型父系遺傳，具有高度的保守性和特異性，遺傳過(guò)程中的序列改變僅由突變引起，因此，進(jìn)行Y染色體全序列測(cè)試，可以獲得以下信息：1)發(fā)現(xiàn)父系家族特有的Y-SNP標(biāo)記位點(diǎn)；2)精確計(jì)算父系家族內(nèi)近幾百年以來(lái)的精確分化時(shí)間；3)確定宗親關(guān)系，明確家族內(nèi)各支系的脈絡(luò)，解決家譜中的模糊或錯(cuò)誤描述，完善家譜信息，還原家族歷史上遷徙與發(fā)展歷史。因此，對(duì)Y染色體進(jìn)行測(cè)序，可應(yīng)用于與男性相關(guān)的司法鑒定，如家系排查，父系追溯等，具有非常重要的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用的價(jià)值。

當(dāng)前法醫(yī)Y染色體檢測(cè)主要為已知的STR(短串聯(lián)重復(fù)序列)和SNP(單核苷酸多態(tài)性)分型：具體包括(1)基于Sanger測(cè)序的STR和SNP分型，其原理是在DNA合成過(guò)程中摻入ddNTP，產(chǎn)生一系列末端終止的DNA鏈，之后通過(guò)凝膠電泳分離大小不同的片段，最后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。(2)基于二代測(cè)序的STR和SNP分型，其主要原理為：①STR和SNP位點(diǎn)捕獲。二代測(cè)序法目前主要采用多重PCR的方法同時(shí)對(duì)多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行捕獲，同時(shí)對(duì)≤1000位點(diǎn)進(jìn)行分型，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)STR和SNP位點(diǎn)的特異性捕獲。②樣本標(biāo)簽的添加。在多重PCR完成第一輪多位點(diǎn)捕獲擴(kuò)增后，需要在第一輪PCR產(chǎn)物的基礎(chǔ)上添加樣本標(biāo)簽及測(cè)序接頭，而后進(jìn)行第二輪PCR。③測(cè)序和結(jié)果判讀。上機(jī)測(cè)序后，每個(gè)樣本的同一個(gè)STR和SNP位置可以讀到數(shù)百條reads，并且能夠清晰看到每條序列的具體信息，通過(guò)對(duì)于位點(diǎn)的聚類分析，實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)基因型的判斷。還有一些基于二代測(cè)序的Y染色體商業(yè)化服務(wù)。其中，F(xiàn)amily Tree DNA(ftDNA)提供的“Big Y”測(cè)試服務(wù)，約檢測(cè)Y染色體11-14M bp的區(qū)域，測(cè)試深度為55-80X。FGC提供“Y-Elite”測(cè)試服務(wù)，約測(cè)12-16M bp的區(qū)域，測(cè)試深度為40-80X。

由于當(dāng)前法醫(yī)Y染色體檢測(cè)主要是基于已知的STR和SNP分型，并不能滿足實(shí)際檢測(cè)的精度要求。具有以下缺點(diǎn)：①?zèng)]有考慮到其他具有區(qū)分能力的STR和SNP位點(diǎn)，無(wú)法探尋未知信息。檢測(cè)結(jié)果雖然可以給出已知的、上游的單倍群的判斷，但無(wú)法得知更加精細(xì)的下游未知的位點(diǎn)的信息，因此只能得到非常粗糙的父系類型信息。②隨著學(xué)術(shù)和商業(yè)研究不斷發(fā)現(xiàn)新的位點(diǎn)，基于之前檢測(cè)得到的結(jié)果與信息就需要再次更新，芯片也要不斷重新升級(jí)；③檢測(cè)過(guò)程中，設(shè)計(jì)進(jìn)去的位點(diǎn)過(guò)多，可能會(huì)出現(xiàn)彼此干擾的現(xiàn)象，導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果自相矛盾。例如專利CN106399543A公開(kāi)了基于74個(gè)Y染色體SNP遺傳標(biāo)記的法醫(yī)學(xué)二代測(cè)序試劑盒，專利CN110846420A公開(kāi)了一種快速突變Y染色體STR分型系統(tǒng)、下一代測(cè)序分型試劑盒及分型方法和應(yīng)用等，所述的Y染色體測(cè)序均主要是基于已知的STR和SNP分型，測(cè)序所包含的區(qū)域較小，無(wú)法達(dá)到法醫(yī)學(xué)精細(xì)譜系研究的目的，且檢測(cè)成本高。而目前基于二代測(cè)序的商業(yè)化試劑盒，具有以下缺點(diǎn)：①測(cè)序的區(qū)域較小，不能發(fā)現(xiàn)更多屬于自身家族獨(dú)有的私有位點(diǎn)，無(wú)法區(qū)分家族內(nèi)部的不同分支，世代估計(jì)的誤差較大，無(wú)法滿足實(shí)際的精度要求。②檢測(cè)成本高，高度依賴于進(jìn)口的測(cè)序平臺(tái)及相關(guān)試劑，價(jià)格昂貴。

因此，亟需開(kāi)發(fā)一種對(duì)Y染色體的測(cè)序長(zhǎng)度更長(zhǎng)，能發(fā)現(xiàn)更多具有區(qū)分能力的STR和Y-SNP位點(diǎn)，測(cè)序所包含的區(qū)域更大，以滿足法醫(yī)學(xué)精細(xì)譜系研究的需求的Y染色體測(cè)序方法。

發(fā)明內(nèi)容