[發明專利]一種非洲豬瘟病毒LAMP-CRISPR檢測用組合物、檢測試劑盒和檢測方法

在審

• 申請號: 202011529612.1
• 申請日: 2020-12-22
• 公開（公告）號: CN112522444A
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發明（設計）人: 鄭海學;楊波;田宏;石正旺;李攀;王麗娟;麻園;羅俊聰;萬穎;宋銳;付輝;袁克湖;朱海
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司 41111
• 代理人: 張立強

本發明公開了一種非洲豬瘟病毒LAMP?CRISPR檢測用組合物、檢測試劑盒和檢測方法，該組合物包括LAMP擴增引物、crRNA和ssDNA熒光報告探針。該試劑盒包括上述組合物，還包括用于LAMP擴增的LAMP反應緩沖液、Bst DNA聚合酶和p72質粒模板，以及用于CRISPR Cas12a檢測體系的LbCas12a、RNase抑制劑、CRISPR反應緩沖液。本發明采用LAMP方法與CRISPR相結合的技術，可高效、精準并且不需借助大型儀器達到檢測結果可視化的目的，為ASFV的快速診斷提供了新的技術支持。本發明建立的LAMP?CRISPR對ASFV抗原分子的檢測具有較高的靈敏度，能夠檢測到單拷貝即7×10⁰copies/μL的質粒濃度。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種非洲豬瘟病毒LAMP-CRISPR檢測用組合物、檢測試劑盒和檢測方法。

背景技術

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的一種感染家豬和各種野豬的急性、出血性、高度接觸性的烈性傳染病，又稱非洲豬瘟疫或疣豬病。非洲豬瘟病毒可以感染不同年齡段的所有豬群，急性癥狀最為常見，3～10天致死，死亡率可以達到100％。該病的臨床癥狀主要表現為發熱、出血以及皮膚發紺，甚至出現血塊。病理剖檢后通常可見脾臟異常腫大和淤血，淋巴結、肝臟和腎臟出血，這些臨床癥狀與經典豬瘟、藍耳病、偽狂犬病等很難區分，因此一般通過實驗室手段進行非洲豬瘟的診斷和確診。

目前非洲豬瘟尚且沒有有效安全的商品化疫苗，國際上主要通過病原學和血清學方法進行非洲豬瘟的診斷。然而，該病對于我國來說是一種新發傳染病，并且由于非洲豬瘟引起的臨床病程較短、發病比較急，通常在病毒抗體產生以前，動物已經發病死亡。因此，我國非洲豬瘟的防控主要應用病原分子學檢測方法。國際動物衛生組織(OIE)將傳統PCR方法和實時熒光定量PCR作為ASFV檢測的金標準。然而，這些檢測方法需要大型的儀器設備、專業人員操作和耗時較長等缺點，限制了該方法在現場的即時檢測。等溫擴增方法如重組酶聚合酶擴增法(RPA)，環介導等溫擴增法(LAMP)和交叉引物核酸恒溫擴增技術(CPA)的應用避免了大型儀器設備的使用，同時等溫擴增方法結合免疫層析條后可以在田間得到應用。但是，這些等溫擴增方法的缺點是特異性和敏感性較低，因此，在非洲豬瘟病毒的檢測中沒有得到推廣。

2020年諾貝爾化學獎獲得者Jennifer Doudna近期基于CRISPR系統開發的被稱作DETECTR的新方法能夠實現靈敏而又準確的DNA檢測。DETECTR檢測依賴于Cas12a酶，一旦Cas12a通過一段CRISPR靶向RNA(crRNA)的引導靶向識別目的DNA序列后，它會變成一種DNA切碎機，將附近的任何單鏈DNA進行切割。基于CRISPR Cas12a的功能與分子信號槍相結合，研究人員已經在人類樣品中發現兩種致癌性的人類乳頭瘤病毒(HPV)。在CRISPR Cas12a識別目的靶序列之前，首先需要對目的序列進行擴增富集，目前多數擴增手段使用RPA反應，因為RPA的最佳反應溫度與Cas12a的最佳切割溫度相近。但是，由于RPA反應所需的酶種類多，價格昂貴，很難能夠實際應用到基層獸醫的病原檢測診斷。

發明內容

本發明的目的在于提供一種避免采用RPA反應、能夠推廣到基層應用的非洲豬瘟病毒LAMP-CRISPR檢測用序列組合物、檢測試劑盒和檢測方法。本發明通過對LAMP的擴增方法與CRISPR Cas12的檢測方法結合成為LAMP-CRISPR的分子檢測試劑盒和檢測方法。該分子檢測方法具有良好的特異性、敏感性、重復性，操作簡便快捷，成本低廉，不需要大型儀器設備，具有可視化的優勢，更有利于對ASFV的分子檢測技術在基層中的推廣和應用。

為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

本發明第一方面提供一種非洲豬瘟病毒LAMP-CRISPR檢測用組合物，包括LAMP擴增引物、crRNA和ssDNA探針；

LAMP擴增引物由內引物和外引物組成：

外引物：