[發明專利]一種非洲豬瘟病毒LAMP-CRISPR檢測用組合物、檢測試劑盒和檢測方法

在審

• 申請號: 202011529612.1
• 申請日: 2020-12-22
• 公開（公告）號: CN112522444A
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發明（設計）人: 鄭海學;楊波;田宏;石正旺;李攀;王麗娟;麻園;羅俊聰;萬穎;宋銳;付輝;袁克湖;朱海
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司 41111
• 代理人: 張立強

1.一種非洲豬瘟病毒LAMP-CRISPR檢測用組合物，其特征在于，包括LAMP擴增引物、crRNA和ssDNA探針；

LAMP擴增引物由內引物和外引物組成：

外引物：

2F3：5’-CTATAAACATATATTCAATGGGCC-3’；

2B3：5’-GCAATATACGCTTTAAACCATG-3’；

內引物：

2FIP：5’-ACGTGTCCATAAAACGCAGGTTTTTCAGACATTAGTTTTTCAT

CGTG-3’；

2BIP：5’-AGGTTGTGTATTTCAGGGGTTACTTTTTCATTAATGAAATCTCG

CTCAC-3’；

crRNA：AAUUUCUACUAAGUGUAGAUAUCGUGGUGGUUAUUGUUGGUGU；

ssDNA探針：FAM:5’-(FAM)CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG(BHQ1)-3’。

2.根據權利要求1所述的一種非洲豬瘟病毒LAMP-CRISPR檢測用組合物，其特征在于，LAMP擴增引物中內引物和外引物濃度比為12 pmol/μL:2pmol/μL。

3.一種非洲豬瘟病毒LAMP-CRISPR檢測用試劑盒，其特征在于，包含權利要求1～2任一項所述的組合物。

4.根據權利要求3所述的一種非洲豬瘟病毒LAMP-CRISPR檢測用試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括用于LAMP擴增的LAMP反應緩沖液、Bst DNA聚合酶和熒光試劑，以及用于CRISPR Cas12a 檢測體系的CRISPR反應緩沖液、LbCas12a和RNase抑制劑。

5.根據權利要求4所述的一種非洲豬瘟病毒LAMP-CRISPR檢測用試劑盒，其特征在于，所述LAMP反應緩沖液由40 mM Tris-HCl，pH 8.8、20 mM KCl， 16 mM MgSO₄，20 mM (NH₄)₂SO₄，0.2% Tween 20，1.6 M Betaine和2.8 mM dNTP組成。

6.根據權利要求4所述的一種非洲豬瘟病毒LAMP-CRISPR檢測用試劑盒，其特征在于，所述crRNA和LbCas12a的摩爾濃度比為1:1。

7.權利要求1～2任一項所述的一種非洲豬瘟病毒LAMP-CRISPR檢測用組合物在非診斷治療目的的非洲豬瘟病毒檢測中的應用。

8.權利要求3～6任一項所述的一種非洲豬瘟病毒LAMP-CRISPR檢測用試劑盒在非診斷治療目的的非洲豬瘟病毒檢測中的應用。

9.一種非診斷治療目的非洲豬瘟病毒LAMP-CRISPR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）使用DNA提取試劑盒提取樣品中的核酸或對樣品進行裂解釋放核酸；

（2）將LAMP反應混合液共18.5 μl和提取的核酸2 μl 共20.5 μl加入到PCR管底部；

（3）將CRISPR反應混合液共4.5 μl加入到PCR管蓋部；

（4）將PCR管置于63℃的反應器中進行30min LMAP擴增；

（5）瞬時離心后將CRISPR反應混合液離心到管底部，并與LAMP擴增產物充分混合；

（6）將PCR管置于37℃進行CRISPR熒光檢測；

（7）將PCR管置于激發波長為485nm的透射光源下觀察顏色變化確定檢測結果。

10.根據權利要求9所述的一種非診斷治療目的非洲豬瘟病毒LAMP-CRISPR檢測方法，其特征在于，所述LAMP反應混合液由以下成分組成：LAMP反應緩沖液、內引物、外引物、BstDNA聚合酶、p72質粒模板、熒光試劑和DEPC水，所述的p72質粒模板中p72的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。