[發明專利]一種基于改性纖維富集的抗痛風藥物篩選方法

在審

• 申請號: 202011525792.6
• 申請日: 2020-12-22
• 公開（公告）號: CN112748209A
• 公開（公告）日: 2021-05-04
• 發明（設計）人: 陶益;陳林;江恩賜;朱菲
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: G01N30/72
• 分類號: G01N30/72
• 代理公司: 杭州之江專利事務所(普通合伙) 33216
• 代理人: 朱楓

本發明公開了一種基于改性纖維富集的抗痛風藥物篩選方法，在聚偏二氟乙烯纖維表面依次覆蓋功能化聚多巴胺、聚乙烯亞胺和黃嘌呤氧化酶得到靶標鍵合纖維，然后將靶標鍵合纖維和待篩選的藥用植物提取物混合、孵育；孵育結束后先用PBS緩沖液清洗，再用變性清洗液進行變性洗脫，然后對變性洗脫物進行液質分析，獲取靶標結合物的相關質譜信息，同時采用表面等離子共振技術分析靶標?小分子的相互作用，獲取KD值，篩選出抗痛風成分。本發明提供的篩選方法能夠用于藥用植物中抗痛風成分的篩選，與傳統植物化學分離篩選方法相比，可顯著提高篩選效率、縮短篩選時間，可重復使用，具有快速、高效、準確、重現性好等優點。

技術領域

本發明涉及一種從藥用植物提取物中篩選抗痛風活性成分的方法，具體涉及一種篩選效率高、環保、能同步進行活性成分富集和鑒定的親和固相微萃取方法，對于抗痛風活性成分的快速篩選具有重要意義。

背景技術

傳統的藥用植物活性成分篩選模式主要是包括兩步：一是通過提取、萃取、柱層析、純化等手段分離單體化合物，二是對單體化合物進行活性測試。整個篩選過程存在繁瑣、耗時、消耗大量有機溶劑、對環境不友好等缺點。固相微萃取技術是一種新興的樣品預處理富集技術，常與氣相色譜-質譜聯用來檢測揮發性成分，分析水、土壤、大氣等化學環境中多環芳烴、微囊藻毒素等有害化學物質和環境污染物。親和固相微萃取技術通過在改性纖維表面固定靶標，制備成靶標萃取纖維，在與配體結合后，取出纖維，與非特異性結合的成分分離，然后用洗脫劑把結合配體洗脫下來。目前，已經開發了很多纖維表面修飾技術來固定靶標。例如，聚多巴胺通過自發的氧化自聚合作用表現出對許多材料的強粘合性能，可以通過邁克爾加成或形成席夫堿與各種生物分子例如蛋白質和酶等進行連接，可用于固定化反應，因此，聚多巴胺被廣泛用于仿生表面改性。

聚乙烯亞胺是一種陽離子聚合物，它包含胺基和兩個碳脂肪族CH₂CH₂間隔基，帶負電的靶標很容易與涂有帶正電的聚乙烯亞胺的纖維結合。與傳統方法相比，親和固相微萃取技術具有快速、高效、有機試劑消耗少、環保等優勢。黃嘌呤氧化酶是抗痛風藥物的主要靶標，應用親和固相微萃取-超高效液相-質譜聯用技術進行黃嘌呤氧化酶抑制劑篩選的方法尚無人報道。而基于改性纖維的活性成分富集技術具有操作時間短、消耗有機試劑少、富集效率高等優點。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于改性纖維富集的抗痛風藥物篩選方法，通過液質-聯用鑒定靶標結合物，用表面等離子體共振技術研究靶標和小分子互作，本發明提供的方法，篩選效率高，準確度高，對于藥用植物中抗痛風成分的篩選具有重要應用價值。

為實現以上目的，本發明采取的技術方案為：

一種基于改性纖維富集的抗痛風藥物篩選方法，包括以下步驟：在聚偏二氟乙烯纖維表面依次覆蓋功能化聚多巴胺、聚乙烯亞胺和黃嘌呤氧化酶得到靶標鍵合纖維，然后將靶標鍵合纖維和待篩選的藥用植物提取物混合、孵育；孵育結束后先用PBS緩沖液清洗，再用變性清洗液進行變性洗脫，然后對變性洗脫物進行液質分析，獲取靶標結合物的相關質譜信息，同時采用表面等離子共振技術分析靶標-小分子的相互作用，獲取KD值，篩選出抗痛風成分。

作為優選方案，變性清洗液為乙腈水溶液或甲醇水溶液。

作為優選方案，孵育結束后先用PBS緩沖液清洗3次，變性清洗液為體積濃度70％的甲醇水溶液。

作為優選方案，將靶標鍵合纖維和待篩選的藥用植物提取物在35℃下孵育20min。

作為優選方案，將靶標鍵合纖維和待篩選的藥用植物提取物混合，加入PBS緩沖液，使孵育溶液的pH在6.7-6.9。

作為優選方案，將靶標鍵合纖維和待篩選的藥物，混合，加入PBS緩沖液，使孵育溶液的離子強度為333-337mM。

以上所述的一種基于改性纖維富集的抗痛風藥物篩選方法，包括以下步驟：