[發(fā)明專利]一種利用魷魚軟骨制備硫酸軟骨素的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011523667.1
• 申請(qǐng)日: 2020-12-22
• 公開（公告）號(hào): CN112625147A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳文惠;楊勁峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 榮成萬盈水產(chǎn)科技有限公司
• 主分類號(hào): C08B37/08
• 分類號(hào): C08B37/08
• 代理公司: 濟(jì)南日新專利代理事務(wù)所(普通合伙) 37224
• 代理人: 李科偉

1.一種利用魷魚軟骨制備硫酸軟骨素的方法，其特征在于，其經(jīng)過以下工藝步驟：

1）硫酸軟骨素裂解酶制備

a.取新鮮鴨小腸，用破壁機(jī)粉碎，按重量份1:5-6添加無菌水制備鴨小腸溶液，攪拌10-20min，用160-180目篩子過濾，然后取濾液涂布培養(yǎng)基，進(jìn)行平板培養(yǎng)分離，接著挑取單菌落，用斜面劃線方法純化；配制含有魷魚軟骨粉末的培養(yǎng)基，將純化后的單菌落點(diǎn)種于培養(yǎng)基平板，30℃-37℃恒溫培養(yǎng)1-3天，向平板中倒入無菌水，浸泡3-5min；挑取產(chǎn)生透明圈的菌株，利用斜面劃線培養(yǎng),控制溫度保持在30℃-37℃，120-150r/min振蕩好氧培養(yǎng)1-3天；培養(yǎng)完成后，接種于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行生產(chǎn)菌的培養(yǎng)，在溫度30-37℃、120-150r/min振蕩通氣培養(yǎng)1-3天，菌體密度為1×10⁸ - 5×10⁸個(gè)/ml時(shí)，即得硫酸軟骨素裂解酶產(chǎn)生菌種子菌液；

b. 按4-6%v/v接種量將硫酸軟骨素裂解酶產(chǎn)生菌種子菌液接入發(fā)酵罐中，在30℃-37℃發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)48-60h發(fā)酵，用低溫離心機(jī)5℃、4000-5500r/min離心20-30min,取上清液，在冰浴中緩緩向上清液中加入氯化鈉、硫酸銨和乙醇復(fù)合物，5℃靜置18-20h，低溫離心機(jī)5℃、8000-10000r/min離心25-38min,取沉淀，用去離子水溶解，轉(zhuǎn)移至透析袋中，透析脫除雜質(zhì)即得硫酸軟骨素裂解酶；

2）魷魚軟骨酶解

a.取魷魚軟骨，用清水沖洗除雜，晾干后用粉碎機(jī)粉碎，加入無水乙醇浸泡2-5h，離心取沉淀，用無水乙醇清洗幾遍，晾干備用；

b.步驟a中備用的魷魚軟骨按重量百分?jǐn)?shù)20%-30%和水混合，按2%-5%混合物重量百分比添加步驟1）b中提取的硫酸軟骨素裂解酶，溫度45-51℃、pH8.5-10、100-120r/min酶解4-6h；

c.酶解完成后，離心除去沉淀，收集上清液并真空濃縮至固形物重量百分含量為30-35%；

3）純化

a.步驟2）中獲得的發(fā)酵濃縮液加入無水乙醇65-80%V/V，并調(diào)節(jié)pH5.2-7.0，攪拌30-60min，靜置4-5h，離心去除上清液；

b.離心沉淀用去離子水溶解，溶液轉(zhuǎn)入透析袋進(jìn)行透析純化，同時(shí)外加0.5-0.8V的直流電場(chǎng)，收集截留液，截留液中加入無水乙醇，使乙醇濃度達(dá)到74-81%V/V，同時(shí)調(diào)節(jié)pH5.5-6.5，靜置8-10h，離心，重復(fù)結(jié)晶2-3次；

4）干燥

將步驟3）中得到的結(jié)晶冷風(fēng)凍干，即得硫酸軟骨素糖蛋白。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用魷魚軟骨制備硫酸軟骨素的方法，其特征在于，在步驟1）中，所述的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中的一種。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用魷魚軟骨制備硫酸軟骨素的方法，其特征在于，在步驟1）中，所述的鴨小腸取自用蝦蟹殼作飼料成分飼喂2-3年的鴨子。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用魷魚軟骨制備硫酸軟骨素的方法，其特征在于，在步驟2）b中，在添加硫酸軟骨素裂解酶前還加入了混合物重量2-4%CaCl2、3-5%乙醇。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種利用魷魚軟骨制備硫酸軟骨素的方法，其特征在于，在步驟2）b中，在添加硫酸軟骨素裂解酶前加入了混合物重量3.5%CaCl2、4%乙醇。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用魷魚軟骨制備硫酸軟骨素的方法，其特征在于，在步驟3）b中，所述的透析袋規(guī)格為4-10kD，且為即用型。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用魷魚軟骨制備硫酸軟骨素的方法，其特征在于，在步驟1）b中，所述的氯化鈉、硫酸銨和乙醇復(fù)合物按重量百分?jǐn)?shù)添加量為85-92%。

8.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的一種利用魷魚軟骨制備硫酸軟骨素的方法，其特征在于，所述步驟1）b中氯化鈉、硫酸銨和乙醇復(fù)合物組成比例為W_氯化鈉：W_硫酸銨：V_乙醇為1:6-8:3，其中W_氯化鈉為氯化鈉添加重量，W_硫酸銨為硫酸銨添加重量，V_乙醇為乙醇添加體積。