[發(fā)明專利]一種轉(zhuǎn)基因修飾的Daudi細(xì)胞及其制備方法、應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011522929.2
• 申請日: 2020-12-22
• 公開（公告）號: CN112626029B
• 公開（公告）日: 2022-12-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭子寬;張滌平;葛四海;謝思倫
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市賽歐細(xì)胞技術(shù)有限公司;北京科霖恩生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N5/0783
• 代理公司: 深圳市精英專利事務(wù)所 44242
• 代理人: 李瑩

本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因修飾的Daudi細(xì)胞，修飾有目標(biāo)基因片段，所述目標(biāo)基因片段表達(dá)mbIL?21。以滅活的所述轉(zhuǎn)基因修飾的Daudi細(xì)胞作為滋養(yǎng)細(xì)胞，與單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)得到的NK細(xì)胞時(shí)，擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)到1500倍以上；CD3^?CD16⁺CD56⁺的頻率大于90％以上，培養(yǎng)所得的NK細(xì)胞純度更高，對K562或其他癌細(xì)胞系有細(xì)胞毒作用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是指一種轉(zhuǎn)基因修飾的Daudi細(xì)胞及其制備方法、應(yīng)用。

背景技術(shù)

NK細(xì)胞作為固有免疫系統(tǒng)的核心成員，是一群不同于T、B細(xì)胞的CD3^-CD56⁺大顆粒淋巴細(xì)胞亞群。NK細(xì)胞無需抗原致敏就可直接殺傷腫瘤和病毒感染的靶細(xì)胞，而且無MHC限制性，應(yīng)答速度快，在機(jī)體抗腫瘤和抗感染免疫早期即可發(fā)揮作用。NK細(xì)胞識別“敵”與“我”無需通過抗原克隆，而是通過其表面的活化性受體和抑制性受體進(jìn)行調(diào)節(jié)，兩者間的平衡及相互作用決定NK的細(xì)胞激活及靜息。

NK細(xì)胞主要來自于外周血中，而外周血中NK細(xì)胞僅占單個(gè)核細(xì)胞的5-20％，這極大限制了NK細(xì)胞在臨床級別上的使用。因此，有必要建立一種高效擴(kuò)增NK細(xì)胞的體系為過繼性細(xì)胞免疫治療鋪平道路。

以往的NK細(xì)胞擴(kuò)增方式都是在體外體系中添加細(xì)胞因子IL-2，IL-15等促使NK細(xì)胞生長，然而這種方法培養(yǎng)出來的細(xì)胞數(shù)目少純度低，穩(wěn)定性也差，且成本較高。最近十年，人們利用基因工程技術(shù)將膜結(jié)合IL-2，IL-15，IL-18等嵌合到K562細(xì)胞上后滅活，以此作為滋養(yǎng)細(xì)胞刺激NK細(xì)胞增殖，該方法加強(qiáng)了NK細(xì)胞特異性增殖，提高NK細(xì)胞的活性和存活時(shí)間，同時(shí)也減少培養(yǎng)時(shí)長和降低成本。不過，隨著增殖次數(shù)的疊加，其端粒逐漸縮短，細(xì)胞的擴(kuò)增能力會(huì)有所下滑，從而不能達(dá)到臨床級別的數(shù)量要求。

對于NK細(xì)胞來說，IL-21可促進(jìn)NK細(xì)胞增殖分化，并上調(diào)其細(xì)胞毒活性，還能誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN等細(xì)胞因子；K562細(xì)胞作為目前最為常用的滋養(yǎng)細(xì)胞，在培養(yǎng)簡便擴(kuò)增迅速的同時(shí)，存在著擴(kuò)增倍數(shù)限制的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：設(shè)計(jì)一種擴(kuò)增倍數(shù)更優(yōu)、純度更高的快速擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種轉(zhuǎn)基因修飾的Daudi細(xì)胞，修飾有目標(biāo)基因片段，所述目標(biāo)基因片段表達(dá)mbIL-21。

進(jìn)一步地，所述目標(biāo)基因片段還表達(dá)IL-15、IL-21、4.1-BBL、CD86、CD314、CD16、IL-18、IL-12、CD14中的一種或幾種。

一種轉(zhuǎn)基因修飾的Daudi細(xì)胞的制備方法，包括依次執(zhí)行的以下步驟：

S1：將目標(biāo)基因片段插入質(zhì)粒中，得到重構(gòu)質(zhì)粒載體；

S2：將所述重構(gòu)質(zhì)粒載體重組至慢病毒中，得到重組慢病毒；

S3：通過所述重組慢病毒轉(zhuǎn)染Daudi細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)基因修飾的Daudi細(xì)胞；

所述目標(biāo)基因片段包含用于表達(dá)mbIL-21的核苷酸序列和/或相應(yīng)的互補(bǔ)序列，所述用于表達(dá)mbIL-21的核苷酸序列為：SEQ ID NO：1。

進(jìn)一步地，在所述步驟S2中，所述慢病毒的具體重組方法為：

先按照0.1-0.8×10⁶個(gè)/ml的濃度往對數(shù)生長期的慢病毒中加入DMEM完全培養(yǎng)基，混勻，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至慢病毒細(xì)胞匯合度達(dá)60-70％，得慢病毒懸液；