[發明專利]一種轉基因修飾的Daudi細胞及其制備方法、應用

有效

• 申請號: 202011522929.2
• 申請日: 2020-12-22
• 公開（公告）號: CN112626029B
• 公開（公告）日: 2022-12-20
• 發明（設計）人: 郭子寬;張滌平;葛四海;謝思倫
• 申請（專利權）人: 深圳市賽歐細胞技術有限公司;北京科霖恩生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N5/0783
• 代理公司: 深圳市精英專利事務所 44242
• 代理人: 李瑩

1.一種轉基因修飾的Daudi細胞，其特征在于，修飾有目標基因片段，所述目標基因片段表達mbIL-21，所述用于表達mbIL-21的核苷酸序列為：SEQ ID NO：1。

2.如權利要求1所述的轉基因修飾的Daudi細胞，其特征在于，所述目標基因片段還表達IL-15、IL-21、4.1-BBL、CD86、CD314、CD16、IL-18、IL-12、CD14中的一種或幾種。

3.一種權利要求1或2任一所述的轉基因修飾的Daudi細胞的制備方法，其特征在于，包括依次執行的以下步驟：

S1：將目標基因片段插入質粒中，得到重構質粒載體；

S2：將所述重構質粒載體重組至慢病毒中，得到重組慢病毒；

S3：通過所述重組慢病毒轉染Daudi細胞，得到轉基因修飾的Daudi細胞；

在所述步驟S1中，所述目標基因片段為用于表達mbIL-21的核苷酸序列和/或相應的互補序列，所述質粒為pCDH-WA6299；

在所述步驟S2中，所述重構質粒載體的核苷酸序列為：SEQ ID NO：2，所述慢病毒為293FT細胞。

4.如權利要求3所述的轉基因修飾的Daudi細胞的制備方法，其特征在于，在所述步驟S2中，所述慢病毒的具體重組方法為：

先按照0.1-0.8×10⁶個/ml的濃度往對數生長期的慢病毒中加入DMEM完全培養基，混勻，置于37 ℃培養箱中培養，直至慢病毒細胞匯合度達60-70%，得慢病毒懸液；

按照1-6μg/ml的量往所述慢病毒懸液中加入所述重構質粒載體，混勻后，放入37 ℃、5%CO₂培養箱中培養6-12h；棄去舊的DMEM完全培養基，加入新的DMEM完全培養基后再培養24-72h；收集上清液。

5.如權利要求4所述的轉基因修飾的Daudi細胞的制備方法，其特征在于，在所述步驟S3中，所述Daudi細胞的具體轉染方法為：按照0.2-5×10⁶個/ml的濃度往Daudi細胞中加入無血清培養基，再加入所述重組慢病毒，混合后，在37 ℃、5%CO₂培養箱中培養24-72h，得轉基因修飾的Daudi細胞。

6.如權利要求5所述的轉基因修飾的Daudi細胞的制備方法，其特征在于，在所述步驟S3中，所添加的重組慢病毒由所述上清液濃縮后加入1-10倍體積的DMEM完全培養基重懸形成；所述上清液的具體濃縮方法為：將所述上清液過濾至離心管中，在10000-12000rpm條件下離心5-20min，收集沉淀；所述重組慢病毒與所述無血清培養基之間的體積比為1:3-50；所述轉基因修飾的Daudi細胞的基因表達在80%以上。

7.一種權利要求1或2任一所述的轉基因修飾的Daudi細胞的應用，其特征在于，以滅活的轉基因修飾的Daudi細胞作為滋養細胞，應用于NK細胞擴增培養中。

8.如權利要求7所述的轉基因修飾的Daudi細胞的應用，其特征在于，所述擴增培養為：按照單個核細胞：滋養細胞=1：0.25-5的數量比例，將單個核細胞和滋養細胞加入至NK細胞培養基中，在37 ℃、5%CO₂條件下進行共培養；

所述共培養方法為：先每隔兩天等體積補加NK細胞培養基，直至細胞密度大于A；當細胞密度大于A時，還按照細胞總數：滋養細胞=1-10：1的比例補加滋養細胞；接著每天等體積補加NK細胞培養基，直至第21天停止，其中，A為6×10⁵個/ml。

9.如權利要求8所述的轉基因修飾的Daudi細胞的應用，其特征在于，所述轉基因修飾的Daudi細胞的滅活方式為：以劑量為50-200 Grays的γ射線輻照15-40min；或以濃度為10mg-200mg/ml的絲裂霉素C篩選30-150min；所述單個核細胞為從外周血或臍血中分離出來的單個核細胞。