[發(fā)明專利]一種在活體細(xì)胞上實(shí)時(shí)檢測(cè)消皮素D的方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011517092.2
• 申請(qǐng)日: 2020-12-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112683867B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 禹子清;陳瑞珍;宿燕崗;葛均波
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64;C12N15/65;C12N15/85
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 徐俊

本發(fā)明涉及一種在活體細(xì)胞上實(shí)時(shí)檢測(cè)消皮素D的方法及其應(yīng)用，屬于醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建含有雙熒光標(biāo)簽標(biāo)記的GSDMD過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，將兩種不同顏色的熒光蛋白序列分別設(shè)置于GSDMD的N端和C端序列外側(cè)，再通過(guò)轉(zhuǎn)染將過(guò)表達(dá)質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染到目的細(xì)胞；通過(guò)熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察熒光變化，反映GSDMD的活化及時(shí)空定位變化；從而提供了一種能夠在活體細(xì)胞上進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)GSDMD的表達(dá)、切割、活化和定位，同時(shí)又能夠兼顧檢測(cè)過(guò)程的簡(jiǎn)潔高效以及檢測(cè)費(fèi)用的相對(duì)低廉的方法，對(duì)于免疫炎癥相關(guān)的研究具有重要意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種在活體細(xì)胞上實(shí)時(shí)檢測(cè)消皮素D的方法及其應(yīng)用，屬于醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

炎癥細(xì)胞死亡的失調(diào)是許多炎癥性疾病的關(guān)鍵因素。焦亡是細(xì)胞死亡的一種高度炎性形式，它利用細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的孔洞破壞電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)并執(zhí)行細(xì)胞死亡。細(xì)胞焦亡是許多疾病惡化到一定程度的表現(xiàn)。消皮素D(Gasdermin?D，GSDMD)是焦亡的成孔效應(yīng)蛋白，它協(xié)調(diào)膜裂解和高炎癥分子的釋放，如白介素-1(IL-1)，增強(qiáng)了先天免疫反應(yīng)的過(guò)度激活。然而，迄今為止，還沒(méi)有破壞焦亡的藥理學(xué)機(jī)制。

研究表明GSDMD被切割后，其氨基端(N端)片段可以定位至細(xì)胞膜表面并形成孔道，改變細(xì)胞膜通透性，從而使細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)可以自由通過(guò)，此時(shí)細(xì)胞外水可自由進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞膨脹和破裂，最終引起細(xì)胞死亡，這一現(xiàn)象稱之為細(xì)胞焦亡。因此，GSDMD是細(xì)胞焦亡的最終效應(yīng)分子。此外，還有研究表明，GSDMD的N端片段(GSDMD-N)可以定位于線粒體膜，并形成孔道，改變線粒體膜通透性，從而使線粒體與細(xì)胞漿內(nèi)環(huán)境相通，線粒體內(nèi)有害物質(zhì)，例如細(xì)胞色素C、線粒體DNA、活性氧類等可以由此孔道釋放，造成細(xì)胞損傷。以上證據(jù)表明，GSDMD的表達(dá)、切割、活化、定位對(duì)細(xì)胞的功能和細(xì)胞命運(yùn)有重要影響。但目前對(duì)GSDMD觀察和檢測(cè)的手段有限，對(duì)組織或細(xì)胞的GSDMD的表達(dá)主要依賴于蛋白免疫印跡法(Western?blot)，若想進(jìn)一步檢測(cè)組織或細(xì)胞的GSDMD及其切割片段在線粒體或胞漿的表達(dá)，則需要將線粒體與胞漿成分分離后分別檢測(cè)。此外，還可以利用免疫電鏡技術(shù)觀察組織或細(xì)胞的GSDMD及其切割片段在細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)(細(xì)胞器)的分布和定位。另外，通過(guò)免疫化學(xué)或免疫熒光染色法也可觀察到甲醛或多聚甲醛固定后的組織或細(xì)胞內(nèi)的GSDMD及其切割片段的表達(dá)和定位。但是，以上方法均無(wú)法在活體或活細(xì)胞上對(duì)GSDMD的表達(dá)、切割、活化、定位進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察和檢測(cè)；而且，以上方法均需要依賴于抗原-抗體反應(yīng)，其方法的敏感性和特異性存在一定問(wèn)題；此外，以上檢測(cè)方法的在時(shí)間或費(fèi)用上需投入較多，例如Western?blot、免疫化學(xué)/熒光染色及線粒體蛋白的提取步驟多，過(guò)程較繁瑣，購(gòu)置相關(guān)抗體較為昂貴；電鏡的樣品制備及檢測(cè)的準(zhǔn)備過(guò)程較久、檢測(cè)費(fèi)用較高。因此，開(kāi)發(fā)出一種能夠在活體細(xì)胞上進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)GSDMD的表達(dá)、切割、活化、定位，同時(shí)又能兼顧檢測(cè)過(guò)程的簡(jiǎn)潔高效以及檢測(cè)費(fèi)用的相對(duì)低廉的方法對(duì)于免疫炎癥相關(guān)的研究有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為解決如何能夠在活體細(xì)胞上進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)GSDMD的表達(dá)、切割、活化、定位，同時(shí)又能夠兼顧檢測(cè)過(guò)程的簡(jiǎn)潔高效以及檢測(cè)費(fèi)用相對(duì)低廉的技術(shù)問(wèn)題。

為達(dá)到解決上述問(wèn)題的目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是提供一種在活體細(xì)胞上實(shí)時(shí)檢測(cè)消皮素D的方法；包括以下步驟：

步驟1：構(gòu)建含有雙熒光標(biāo)簽標(biāo)記的GSDMD過(guò)表達(dá)質(zhì)粒；

步驟2：用上述步驟1中獲得的質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染；對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行藥物干預(yù)誘導(dǎo)炎癥小體活化及下游GSDMD切割；

步驟3：通過(guò)熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)弱和顏色的變化；

步驟4：通過(guò)線粒體熒光染色標(biāo)記線粒體，通過(guò)熒光共定位觀察GSDMD活性片段在線粒體上的定位情況。

優(yōu)選地，上述步驟1中雙熒光標(biāo)簽標(biāo)記GSDMD設(shè)為兩種不同顏色的熒光蛋白序列設(shè)于GSDMD的N端和C端序列外側(cè)。