[發(fā)明專利]一種在活體細(xì)胞上實(shí)時(shí)檢測消皮素D的方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011517092.2
• 申請日: 2020-12-21
• 公開（公告）號(hào): CN112683867B
• 公開（公告）日: 2023-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 禹子清;陳瑞珍;宿燕崗;葛均波
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64;C12N15/65;C12N15/85
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 徐俊

1.一種在活體細(xì)胞上實(shí)時(shí)檢測消皮素D的方法；其特征在于，包括以下步驟：

步驟1：構(gòu)建含有雙熒光標(biāo)簽標(biāo)記的GSDMD過表達(dá)質(zhì)粒；

步驟2：用上述步驟1中獲得的質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染；對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行藥物干預(yù)誘導(dǎo)炎癥小體活化及下游GSDMD切割；

步驟3：通過熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)弱和顏色的變化；

步驟4：通過線粒體熒光染色標(biāo)記線粒體，通過熒光共定位觀察GSDMD活性片段在線粒體上的定位情況。

2.如權(quán)利要求1所述的一種在活體細(xì)胞上實(shí)時(shí)檢測消皮素D的方法，其特征在于：所述步驟1中雙熒光標(biāo)簽標(biāo)記GSDMD設(shè)為兩種不同顏色的熒光蛋白序列設(shè)于GSDMD的N端和C端序列外側(cè)。

3.如權(quán)利要求2所述的一種在活體細(xì)胞上實(shí)時(shí)檢測消皮素D的方法，其特征在于：所述GSDMD的N端序列外側(cè)設(shè)有藍(lán)色熒光蛋白BFP序列。

4.如權(quán)利要求3所述的一種在活體細(xì)胞上實(shí)時(shí)檢測消皮素D的方法，其特征在于：所述GSDMD的C端序列外側(cè)設(shè)有黃色熒光蛋白EYFP序列。

5.如權(quán)利要求4所述的一種在活體細(xì)胞上實(shí)時(shí)檢測消皮素D的方法，其特征在于：所述步驟4中線粒體熒光染色標(biāo)記采用mitochondria線粒體綠色熒光探針。

6.如權(quán)利要求1至5中任何一項(xiàng)所述的一種在活體細(xì)胞上實(shí)時(shí)檢測消皮素D的方法在誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型中的應(yīng)用。

7.如權(quán)利要求1至5中任何一項(xiàng)所述的一種在活體細(xì)胞上實(shí)時(shí)檢測消皮素D的方法在藥物干預(yù)細(xì)胞炎癥反應(yīng)檢測中的應(yīng)用。

8.如權(quán)利要求1至5中任何一項(xiàng)所述的一種在活體細(xì)胞上實(shí)時(shí)檢測消皮素D的方法在細(xì)胞炎癥反應(yīng)檢測試劑盒中的應(yīng)用。