[發(fā)明專利]siRNA的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011508174.0
• 申請日: 2020-12-18
• 公開（公告）號(hào): CN112626152A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄧?yán)?/a>;譚景云;香鳳;蘭文升
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳大學(xué);深圳市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12P19/34
• 分類號(hào): C12P19/34;C12N15/10
• 代理公司: 深圳中一聯(lián)合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44414
• 代理人: 方良

本申請涉及核酸提取技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種siRNA的制備方法，該制備方法包括如下步驟：體外轉(zhuǎn)錄獲得目的基因的dsRNA；用RNase Ⅲ對所述目的基因的dsRNA進(jìn)行消化處理，得到消化產(chǎn)物；將所述消化產(chǎn)物凝膠電泳后，切割核酸片段＜30bp的膠塊；將所述膠塊研磨凍融后，獲得siRNA。該制備方法具有準(zhǔn)確有效、操作簡便、成本低廉的特點(diǎn)，為純化siRNA以及RNAi研究帶來極大的方便，具有很好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本申請屬于核酸提取技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種siRNA的制備方法。

背景技術(shù)

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是近年發(fā)展起來的一種阻抑基因表達(dá)的新方法，該技術(shù)可以通過雙鏈RNA的介導(dǎo)，降解靶基因的mRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平上特異性地阻斷或降低靶基因的表達(dá)，達(dá)到類似基因敲除的效果，而操作比基因敲除簡單，有著投入少、實(shí)驗(yàn)周期短等優(yōu)勢，是一種可以大量進(jìn)行基因功能檢測的高效且經(jīng)濟(jì)的研究方法，已經(jīng)被廣泛用于研究特定基因的功能。

在RNAi實(shí)驗(yàn)中，獲得小干擾RNA(Small interfering RNA，siRNA)是沉默靶基因的首要步驟。目前有多種方法制備siRNA，其中較為常用的有化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄法、體內(nèi)載體表達(dá)法、siRNA表達(dá)框架法、RNaseⅢ體外消化dsRNA(Double-stranded RNA，雙鏈RNA)法等。

一個(gè)基因的不同siRNA對其可能會(huì)有顯著不同的抑制效果，化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄法、體內(nèi)載體表達(dá)法、siRNA表達(dá)框架法等均需要尋找和驗(yàn)證最有效的siRNA，因而可能會(huì)消耗更多時(shí)間。而使用RNaseⅢ消化長dsRNA制備法無需驗(yàn)證和尋找有效地特定siRNA，可以很好地解決這個(gè)問題，為研究者節(jié)省不少經(jīng)費(fèi)及時(shí)間。該方法主要步驟為：先通過PCR制備DNA模板(在PCR引物地5’端加上T7啟動(dòng)子序列，以啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄)，使用加上T7啟動(dòng)子序列的DNA模板體外轉(zhuǎn)錄制備dsRNA，然后使用大腸桿菌RNaseⅢ消化dsRNA，形成siRNA片段，去除未消化的dsRNA即可純化得到siRNA混合物。該方法得到的產(chǎn)物含有多種不同序列的siRNA，不同siRNA可能存在序列的重疊，幾乎可以覆蓋整個(gè)靶區(qū)段，不必篩選有效片段即可保證可有效降解靶mRNA，適合快速經(jīng)濟(jì)地研究某一基因功能缺失的表型。然而RNaseⅢ消化長dsRNA除了產(chǎn)生12-30bp的短的dsRNA，也產(chǎn)生一些＞30bp的dsRNA。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，長度超過30bp的長dsRNA不僅無法觸發(fā)細(xì)胞中的RNAi，而且會(huì)激活通常由IFN誘導(dǎo)的dsRNA依賴的激酶PKR和2'-5'-寡腺苷酸合成酶。激活的PKR通過磷酸化翻譯因子真核起始因子2α來抑制翻譯過程，而2'-5'-寡腺苷酸合成酶則通過激活RNase L引起非特異性mRNA降解，從而對細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生毒性作用。因此，需要對RNaseⅢ消化后的產(chǎn)物進(jìn)行純化，以獲得較純的12-30bp的siRNA。

dsRNA的分子量＝堿基數(shù)(bp)x 680Da/bp，那么30bp dsRNA對應(yīng)的分子量即為20.4kDa。因此，目前普遍采用30kDa的超濾管純化RNaseⅢ消化后的dsRNA混合物。然而，超濾管價(jià)格昂貴，不適用于需要研究多個(gè)基因的大量制備siRNA；而且超濾管純化在上樣前需要將RNaseⅢ消化的混合物稀釋，導(dǎo)致純化的siRNA濃度較低，需要再次進(jìn)行siRNA濃縮步驟，操作較繁瑣。

因此，相關(guān)技術(shù)有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容

本申請的目的在于提供一種siRNA的制備方法，旨在解決現(xiàn)有RNaseⅢ體外消化dsRNA制備siRNA成本高、步驟繁瑣的技術(shù)問題。

為實(shí)現(xiàn)上述申請目的，本申請采用的技術(shù)方案如下：

本申請?zhí)峁┮环NsiRNA的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

體外轉(zhuǎn)錄獲得目的基因的dsRNA；

用RNaseⅢ對所述目的基因的dsRNA進(jìn)行消化處理，得到消化產(chǎn)物；