[發明專利]一種永生化臍帶間充質干細胞的制備方法及其外泌體制備方法和應用

在審

• 申請號: 202011507881.8
• 申請日: 2020-12-18
• 公開（公告）號: CN112695015A
• 公開（公告）日: 2021-04-23
• 發明（設計）人: 陳錦陽;莊樂南;林志偉;莊盼;劉軍權
• 申請（專利權）人: 浙江衛未生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;A61K35/28;A61K48/00;A61P17/02;A61P3/10
• 代理公司: 北京沁優知識產權代理有限公司 11684
• 代理人: 田婕

本發明公開了一種永生化臍帶間充質干細胞的制備方法，包括臍帶間充質干細胞的分離培養，通過Phoenix細胞制備逆轉錄病毒，制備穩定的感染細胞，培養篩選細胞克隆和擴增培養的步驟。本發明還公開了采用該永生化臍帶間充質干細胞的外泌體的制備方法，以及該外泌體的應用。本發明提供了能夠穩定制備永生化臍帶間充質干細胞hTERT?hUC?MSCs，制得的hTERT?hUC?MSCs能夠得到無限增殖的克隆細胞系用于外泌體生產，并且提供了的外泌體的應用。

技術領域

本發明涉及細胞永生化技術領域，特別涉及一種永生化臍帶間充質干細胞的制備方法及其外泌體制備方法和應用。

背景技術

外泌體，是一種能被機體內大多數細胞分泌的直徑大約為30-150nm的具有脂質雙層膜的微小膜泡，包含了復雜RNA和蛋白質的小膜泡。它們存在于生物液中，例如尿液，血漿和腹水。與以前的外泌體作為攜帶細胞廢物的垃圾袋的概念不同，隨著研究人員開始揭示外泌體的生理和病理作用，外泌體受到了很多關注。已顯示細胞外泌體可以將生物分子(例如脂質，蛋白質和RNA)轉移到其他細胞，遠端器官，甚至其他生物。外泌體通過受體介導的結合與其靶細胞相互作用，然后它們可以與細胞膜融合以將內含物釋放到細胞中，或者通過內吞作用被帶入細胞，在此過程中，它們被放入內吞囊泡中，參與不同的生物學功能，如具有抑制炎癥反應、免疫調節、血管生成、參與組織修復的功能。越來越多的研究工作一直致力于評價外泌體作為治療劑，液體活檢的診斷工具，遞送系統的藥物，或化妝品。

外泌體技術作為遞送平臺的臨床前和臨床開發需要大量外泌體。要求外泌體的分離方法易于擴展以支持大規模生產。

當前的方法產生的外泌體產量低且無法擴展，這種情況到目前為止阻礙了評估動物中的外泌體臨床前療效的研究。大多數外泌體由不同類型的人類細胞產生，包括干細胞，樹突狀細胞，肥大細胞，巨噬細胞，上皮細胞和癌細胞。然而，人類細胞的培養存在許多問題亟待解決。首先，這些細胞在經歷衰老過程后反復傳代培養后停止分裂。其次，許多人類細胞是粘附的，這意味著它們在基質上以單層形式生長，一旦達到匯合，它們就會停止分裂，第三，干細胞的培養受到其在擴增過程中分化為各種細胞類型的內在潛力的挑戰，因此可能釋放出具有不可預測特性的外泌體混合物，第四，由于以上3個問題導致了重現性困難，例如外泌體的細胞來源，特別是原代細胞，同時不同的分離方法和培養條件其外泌體質量也不一樣。

動物和臨床研究表明，間充質干細胞(MSC)在軟骨修復中起重要作用。基于間充質干細胞的療法的治療作用已被越來越多地證明為外泌體介導的旁分泌。自Mitchell等首次自臍帶中成功地分離出臍帶間充質干細胞(hUC-MSCs)，并證實其神經分化潛能后，對臍帶組織來源間充質干細胞的研究引起了廣泛關注，越來越多的研究集中到該領域中。目前許多研究小組已成功從臍帶中分離出臍帶間充質干細胞(hUC-MSCs)，主要分離方法為直接組織塊貼壁培養和酶消化法等方法。利用直接組織塊貼壁法接種0-7天處于潛伏期，細胞無明顯增殖。第8天開始進入對數生長期，持續至第12天左右，進入平臺期。在顯微鏡下觀察，細胞呈長梭狀，單核，傳代后細胞形態趨于一致，成放射或漩渦狀排列。細胞可穩定傳代，

人臍帶間充質干細胞在傳至10代后仍可維持干細胞的活性，但臨床運用分化控制在7代內。MSC的擴展能力有限。從長遠來看，只有不斷補充來自新供體的新來源的MSC。不僅成本高昂，因為必須測試和驗證每個新來源，而且外來體生產的批次質量和可重復性也可能受到損害。在任何一種生物制劑被允許用于臨床試驗之前，需要確定其性質，純度，可再現性，無菌性，效力/功效以及最重要的是，確定該生物制劑的安全性。

此外，由于治療所需的細胞數量通常很高，因此在臨床應用中使用MSC的另一挑戰涉及其離體擴增的有限壽命。盡管在體外良好的增殖率，間充質干顯著降低細胞增殖和經歷復制性衰老。

發明內容

本發明的目的是提供一種永生化臍帶間充質干細胞的制備方法，成品率高，得到的永生化臍帶間充質干細胞能夠多代繁衍。

本發明的上述技術目的是通過以下技術方案得以實現的：