[發明專利]一種永生化臍帶間充質干細胞的制備方法及其外泌體制備方法和應用

在審

• 申請號: 202011507881.8
• 申請日: 2020-12-18
• 公開（公告）號: CN112695015A
• 公開（公告）日: 2021-04-23
• 發明（設計）人: 陳錦陽;莊樂南;林志偉;莊盼;劉軍權
• 申請（專利權）人: 浙江衛未生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;A61K35/28;A61K48/00;A61P17/02;A61P3/10
• 代理公司: 北京沁優知識產權代理有限公司 11684
• 代理人: 田婕

1.一種永生化臍帶間充質干細胞的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一：以臍帶為原料，將原代臍帶間充質干細胞傳代培養，得到臍帶間充質干細胞(hUC-MSCs)；

步驟二：通過Phoenix細胞制備逆轉錄hTERT病毒，得到逆轉錄病毒顆粒；

步驟三：將逆轉錄病毒顆粒旋轉接種感染臍帶間充質干細胞，并進行培養得到待分離細胞群；

步驟四：采用選擇性培養基將待分離細胞中未感染的細胞殺死，再換用正常培養基繼續培養至有抗性的細胞克隆出現；

步驟五：挑取細胞克隆進行擴增培養，得到穩定表達hTERT基因的永生化基因工程細胞系hTERT-hUC-MSCs。

2.根據權利要求1所述的永生化臍帶間充質干細胞的制備方法，其特征在于，步驟二中通過Phoenix細胞制備逆轉錄病毒的過程為：將Phoenix細胞株鋪在100mm培養皿上，在10％FBS/DMEM中生長；取10μg pBABE-neo-hTERT質粒用Opti-MEM上下吹打混合至970μl，然后，加入30μlX-tremeGENE HP DNA轉染試劑，并將該混合物在室溫下孵育25min；之后，將混合物以滴加的方式添加到培養皿中；轉染的Phoenix細胞在37℃、5％CO₂培養箱中培養24h，隨后將培養基放置于用32℃培養箱進行反轉錄病毒制備；在32℃下溫育后，收集上清液，并用0.45μm細菌膜濾器進行過濾。每ml逆轉錄病毒上清液加入8μg HDMB并混勻，制備完成逆轉錄病毒顆粒。

3.根據權利要求1所述的永生化臍帶間充質干細胞的制備方法，其特征在于，步驟三中旋轉接種前，先將hUC-MSCs消化后接種于6孔板，等待細胞匯合度達70％后進行旋轉接種。

4.根據權利要求3所述的永生化臍帶間充質干細胞的制備方法，其特征在于，步驟三在6孔板的每個孔中添加1.5ml體積的逆轉錄病毒顆粒。

5.根據權利要求1所述的永生化臍帶間充質干細胞的制備方法，其特征在于，步驟四中年該選擇性培養基采用含有100μg/ml的G418的選擇性培養基。

6.一種永生化基因工程細胞系外泌體的制備方法，其特征在于，以永生化基因工程細胞系hTERT-hUC-MSCs來生產質量穩定外泌體，采用超高速度離心法提取外泌體。

7.根據權利要求6所述的永生化基因工程細胞系外泌體的制備方法，其特征在于，以永生化基因工程細胞系hTERT-hUC-MSCs來生產外泌體包括如下步驟：

步驟一：將P6代和P35代hTERT-hUC-MSCs用α-MEM完全培養基傳代，進一步擴大培養至細胞匯合度達80％左右，棄培養基，PBS清洗3次，換成不含有血清的α-MEM培養基饑餓48h，收集饑餓后的培養基，所得的培養基于4℃，2000×g離心10min，棄沉淀，收集上清；

步驟二：將步驟一所得上清于4℃，10000×g離心1h，棄沉淀，收集上清，用0.22μm真空過濾器過濾，收集濾液；

步驟三：將步驟二中濾液于4℃，100000×g離心1h，棄上清，收集沉淀；

步驟四：將所得沉淀用培養基等體積的PBS將沉淀重懸，于4℃，100000×g離心1h，棄上清，收集沉淀，所得沉淀用100-200μl PBS將沉淀重懸，得到外泌體。

8.權利要求6-7任一所述永生化基因工程細胞系外泌體在皮膚損傷修復中的應用。