[發(fā)明專利]一種新的短串聯(lián)重復(fù)序列等位基因階梯的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011507658.3
• 申請日: 2020-12-18
• 公開（公告）號: CN113322310B
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李湘萍;胡博;謝龍旭;李烈軍;邱美蘭
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州凱普醫(yī)藥科技有限公司;北京凱普醫(yī)學(xué)檢驗實驗室有限公司;廣東凱普生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 孫鳳俠

本發(fā)明公開了一種新的短串聯(lián)重復(fù)序列(Short Tandem Repeats，STR)等位基因階梯的制備方法。該方法主要根據(jù)基因座上的STR信息設(shè)計并合成PCR擴(kuò)增引物和質(zhì)粒，以合成的質(zhì)粒作為PCR擴(kuò)增模板，把同一基因座的所有等位基因進(jìn)行一管擴(kuò)增，再根據(jù)差異情況進(jìn)行分組擴(kuò)增，最后進(jìn)行純化和適當(dāng)稀釋后獲得制備好的短串聯(lián)重復(fù)序列等位基因階梯。本發(fā)明實現(xiàn)了用較少的PCR反應(yīng)次數(shù)得到均衡性較好的等位基因階梯的目的，可保證每個等位基因片段產(chǎn)物量的均衡而無需進(jìn)行特別調(diào)整，節(jié)省了制備過程中的生產(chǎn)成本、人力成本和時間成本，大大提高了工作效率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因檢測技術(shù)、基因工程領(lǐng)域，更具體地，涉及一種新的短串聯(lián)重復(fù)序列等位基因階梯的制備方法。

背景技術(shù)

短串聯(lián)重復(fù)序列(Short Tandem Repeats,STR)是由2-6bp重復(fù)單位構(gòu)成的核心序列，是一種廣泛分布在人類基因組中的DNA片段，主要由核心重復(fù)序列拷貝數(shù)的變化產(chǎn)生長度多態(tài)性，遵循孟德爾遺傳規(guī)律，遺傳穩(wěn)定，是目前普遍應(yīng)用的遺傳標(biāo)記，被廣泛地應(yīng)用在遺傳學(xué)、法醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、腫瘤學(xué)、基因診斷中的個體識別、親權(quán)鑒定、腫瘤診斷等領(lǐng)域。

STR在法醫(yī)學(xué)個體識別和親權(quán)鑒定中，最常用的方法是先通過PCR擴(kuò)增STR基因座，再通過毛細(xì)管電泳平臺對不同大小的片段進(jìn)行分離，最后樣品峰與標(biāo)準(zhǔn)參照物比對確定等位基因，在這個過程中實現(xiàn)準(zhǔn)確分型的標(biāo)準(zhǔn)參照物就是等位基因階梯，由此可見，等位基因階梯在STR最終分型結(jié)果判讀中具有重要作用。

國內(nèi)已有的短串聯(lián)重復(fù)序列等位基因階梯的制備方法一般有以下幾種：

(1)從人的有核細(xì)胞中提取DNA，根據(jù)STR基因座設(shè)計并合成PCR擴(kuò)增引物,用PCR方法擴(kuò)增STR基因座，通過大量樣本來篩選尋找各基因座的等位基因型，對各基因座的等位基因片段進(jìn)行序列分析，測定各片段的堿基數(shù)和串聯(lián)單位數(shù)，以獲得不同等位基因型的DNA樣本或擴(kuò)增產(chǎn)物，對不同等位基因型的DNA樣本進(jìn)行混合，以混合的DNA樣本作為擴(kuò)增模板，采用相應(yīng)的PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行純化定量得到等位基因階梯。

(2)從人有核細(xì)胞中提取DNA，用PCR方法擴(kuò)增STR基因座以得到各基因座對應(yīng)的等位基因型，對不同等位基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因克隆以獲得每一個等位基因?qū)?yīng)的質(zhì)粒，或者采用全基因合成得到各基因座所有等位基因?qū)?yīng)的質(zhì)粒。將具有不同等位基因的質(zhì)粒進(jìn)行等量混合，以混合質(zhì)粒為擴(kuò)增模板，采用相應(yīng)的PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行純化定量得到等位基因階梯。

(3)或者以上述(2)的DNA樣本或質(zhì)粒為模板，采用相應(yīng)的PCR引物對單個等位基因進(jìn)行擴(kuò)增，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化定量后混合各個等位基因得到STR基因座的等位基因階梯。

(4)又或者將上述的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行稀釋后再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以第二次擴(kuò)增的產(chǎn)物為STR基因座的等位基因階梯。

上述制備方案的缺點主要體現(xiàn)在：

采用上述方案制備等位基因階梯，從人有核細(xì)胞中提取DNA進(jìn)行擴(kuò)增，提取樣本過程不僅繁瑣、工作量大，還會出現(xiàn)部分等位基因難以收集齊全的情況，且還需要對大量樣本進(jìn)行篩選，這個過程費時費力，不適合大批量生產(chǎn)。而且為了生產(chǎn)能夠延續(xù)下去，需要一直收集DNA樣本，不同模板的質(zhì)量差異會使不同批次的等位基因出現(xiàn)質(zhì)量差異。采用樣本DNA或質(zhì)粒作為模板對單個等位基因進(jìn)行擴(kuò)增后對產(chǎn)物進(jìn)行純化定量混合，則需要對兩、三百個片段進(jìn)行幾百次擴(kuò)增，工作量過大，不同等位基因間的微小差異經(jīng)過擴(kuò)增后會出現(xiàn)顯著差異，難以準(zhǔn)確進(jìn)行定量混合，而準(zhǔn)確定量混合難度大且麻煩，造成不同等位基因間均衡性較差，同時對生產(chǎn)車間的環(huán)境要求高。而全部等位基因一起擴(kuò)增雖然可以大大減少工作量，擴(kuò)增過程中片段較短的可以得到較好的擴(kuò)增，但是長片段的產(chǎn)物不容易等量擴(kuò)增，使擴(kuò)增產(chǎn)物的量差異較大，甚至有少數(shù)等位基因無擴(kuò)增產(chǎn)物，造成最終制備的等位基因階梯的各個等位基因均衡性差。