[發明專利]一種新的短串聯重復序列等位基因階梯的制備方法

有效

• 申請號: 202011507658.3
• 申請日: 2020-12-18
• 公開（公告）號: CN113322310B
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發明（設計）人: 李湘萍;胡博;謝龍旭;李烈軍;邱美蘭
• 申請（專利權）人: 廣州凱普醫藥科技有限公司;北京凱普醫學檢驗實驗室有限公司;廣東凱普生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 孫鳳俠

1.一種短串聯重復序列等位基因階梯的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1.設計并制備擴增基因座上的短串聯重復序列的引物，包括正向引物和反向引物，其中，正向引物的5’端采用熒光基團標記；所述基因座為vWA、D7S820或D8S1179；

S2.制備含有目的片段的質粒，所述目的片段由步驟S1所述引物擴增，各目的片段分別含有基因座上不同的等位基因；所述vWA基因座總共合成13個質粒，核心單元TCTA重復數分別為：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22；所述D7S820基因座總共合成12個質粒，核心單元TCTA重復數為：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16；所述D8S1179基因座總共合成13個質粒，核心單元TCTA重復數為：7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19；

S3.以步驟S1的引物PCR擴增步驟S2的質粒，進行毛細管電泳，檢測帶有不同等位基因的質粒的擴增產物的熒光信號強度；

S4.根據熒光信號強度值，對步驟S2的質粒進行分組：

所述vWA基因座的質粒分組為：10；11、12；13、15、16；14、17、18；19、20；21；22；

所述D7S820基因座的質粒分組為：5、6、7；8；9、10、15；11、14；12、13、16；

所述D8S1179基因座的質粒分組為： 7；8、18；9、10；11；12、13；14、15；16、17、19；

S5.以步驟S4分組后的各組質粒作為模板，以步驟S1的引物進行PCR擴增，進行毛細管電泳，檢測各質粒的擴增產物的熒光信號強度值；

S6.確定各組質粒的擴增產物在該基因座短串聯重復序列等位基因階梯中的份數：

(1)當該組只有一種質粒，則該組的擴增產物在短串聯重復序列等位基因階梯中的份數為組內質粒的擴增產物的熒光信號強度值的倒數；

(2)當該組多于一種質粒，則該組的擴增產物在短串聯重復序列等位基因階梯中的份數為組內各質粒的擴增產物的熒光信號強度值倒數的平均數；

S7.按照步驟S6的份數混合各組擴增產物，即得到短串聯重復序列等位基因階梯。

2.根據權利要求1所述等位基因階梯的制備方法，其特征在于，步驟S1所述熒光基團為6’-FAM、VIC、NED或PET之一。

3.根據權利要求1所述等位基因階梯的制備方法，其特征在于，步驟S3和S5所述引物的終濃度為0.09～1.2μM。

4.根據權利要求3所述等位基因階梯的制備方法，其特征在于，步驟S3和S5所述PCR擴增的體系為：含15mM MgCl₂的10×PCR Buffer 3μL，25mM MgCl₂ 0.12μL，25mM dNTP mix0.24μL，終濃度為0.09～1.2μM的引物，5U/μL HotStarTaq DNA Polymerase 0.432μL，每個質粒48pg，ddH₂O補足30μL。

5.根據權利要求1所述等位基因階梯的制備方法，其特征在于，步驟S3和S5所述PCR擴增的熱循環程序為：95℃ 15min；94℃ 45s，60℃ 45s，72℃ 1min，30個循環；72℃ 30min；4℃保存。

6.根據權利要求1所述等位基因階梯的制備方法，其特征在于，步驟S7所述的短串聯重復序列等位基因階梯進行純化和稀釋。

7.根據權利要求6所述等位基因階梯的制備方法，其特征在于，所述純化的方法為磁珠純化。

8.根據權利要求4所述等位基因階梯的制備方法，其特征在于，將制備得到的短串聯重復序列等位基因階梯用緩沖液稀釋10～20倍。

9.權利要求1～8中任一所述等位基因階梯的制備方法所制備的短串聯重復序列等位基因階梯。