[發(fā)明專利]一種間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011507641.8
• 申請(qǐng)日: 2020-12-18
• 公開（公告）號(hào): CN112522191B
• 公開（公告）日: 2023-05-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李天晴;馮春
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南中科靈長(zhǎng)類生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 張璐

本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。在該培養(yǎng)方法中，使用本發(fā)明優(yōu)化后的無血清培養(yǎng)基對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。此外，本發(fā)明還針對(duì)3D培養(yǎng)提供了更優(yōu)的培養(yǎng)方法。通過本發(fā)明培養(yǎng)方法所獲得的細(xì)胞增殖能力強(qiáng)、形態(tài)完整、分泌能力強(qiáng)，符合國際對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，本發(fā)明的培養(yǎng)方法可在占用較小空間、消耗很少培養(yǎng)基、操作更簡(jiǎn)便、工作量大大減少的條件下，通過很少的間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增獲得大量的間充質(zhì)干細(xì)胞(尤其是人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞)，為臨床領(lǐng)域上獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)的間充質(zhì)干細(xì)胞(尤其是人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞)及其分泌物提供了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)方案和理論依據(jù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal?stem?cells，MSC)是指存在于人體多種組織中的多功能干細(xì)胞，是一種非成熟細(xì)胞，具備自我復(fù)制和多向分化能力，在一定條件下可分化為多種功能細(xì)胞的干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)環(huán)境下具有定向誘導(dǎo)分化及修復(fù)的能力，即實(shí)現(xiàn)損傷組織按需修復(fù)與再生的可能。

間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)入機(jī)體后，經(jīng)過血液循環(huán)系統(tǒng)返回心臟，然后經(jīng)由心臟隨血液到達(dá)全身各部器官和組織，或在招募因子的影響下，到達(dá)損傷部位，在機(jī)體特定部位微環(huán)境如：轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)因子、機(jī)械壓力等條件的誘導(dǎo)下使得干細(xì)胞的基因表達(dá)發(fā)生一系列的改變，最終分化成為與所處環(huán)境細(xì)胞相同的具有特定功能的終末細(xì)胞，隨后利用機(jī)體血液循環(huán)帶來的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行增殖，從而對(duì)病變組織起到修復(fù)和再生的作用，最新的研究?jī)?nèi)容認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和外泌體可繼承間充質(zhì)干細(xì)胞的諸多治療特性，且安全性更好，凍干后的細(xì)胞因子和外泌體還可以長(zhǎng)期保存和長(zhǎng)途運(yùn)輸，這大大增加了臨床應(yīng)用的便捷性。

鑒于間充質(zhì)干細(xì)胞及細(xì)胞因子、外泌體的多種生物學(xué)特性及臨床意義，目前已有大量間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞因子、外泌體的成功應(yīng)用案例，然而要進(jìn)行臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及其分泌產(chǎn)物的臨床應(yīng)用，需要大量?jī)?yōu)質(zhì)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，而以往的血清以及無血清培養(yǎng)方案均面臨細(xì)胞易老化、生物學(xué)特性無法長(zhǎng)期維持等問題，使獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞較為困難。因此，一個(gè)優(yōu)質(zhì)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)體系還需要滿足規(guī)模化擴(kuò)增的特性。

目前，進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞規(guī)模化擴(kuò)增的主要方式是進(jìn)行臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的大規(guī)模二維細(xì)胞瓶培養(yǎng)，如CN?109468274?A中提到了一種利用細(xì)胞工廠培養(yǎng)瓶大規(guī)模二維擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，然而這種傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式有諸多缺陷，大量細(xì)胞培養(yǎng)瓶的使用增加了成本、容易污染，且這種傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)方式細(xì)胞要求嚴(yán)格的細(xì)胞密度控制，高密度下細(xì)胞快速衰老，低密度又嚴(yán)重限制了細(xì)胞產(chǎn)量。

為應(yīng)對(duì)貼壁細(xì)胞的規(guī)模化培養(yǎng)，近年興起了微載體培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)方法借鑒了傳統(tǒng)的懸浮培養(yǎng)，通過添加細(xì)胞貼壁所需的生物材料制成的顆粒狀、片狀或中空纖維載體，使細(xì)胞貼附于載體上，而后將載體置于生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)。使用微載體培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞具有表面積/體積大的優(yōu)點(diǎn)，單位體積培養(yǎng)液可獲得更高的細(xì)胞產(chǎn)量，培養(yǎng)基利用率高，容易放大，可從較低密度實(shí)現(xiàn)細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)增，勞動(dòng)密度小，培養(yǎng)系統(tǒng)占地面積小且不易污染，單位時(shí)間內(nèi)可獲得更多細(xì)胞。因此，間充質(zhì)干細(xì)胞的微載體培養(yǎng)被認(rèn)為是短時(shí)間內(nèi)獲取大量?jī)?yōu)質(zhì)間充質(zhì)干細(xì)胞以滿足臨床應(yīng)用的最佳方案。比如，CN?111424011?A就提供了一種能夠維持臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)的三維培養(yǎng)方法，然而其所使用的無血清培養(yǎng)基中含有第三方提供的血清替代物添加劑，而這類無血清培養(yǎng)基的具體成分未知，且采購的無血清添加劑中往往包含動(dòng)物源蛋白，無法完全排除異源病毒的危險(xiǎn)。此外，這種傳統(tǒng)的三維生物反應(yīng)器培養(yǎng)的細(xì)胞易受機(jī)械損傷，而且細(xì)胞也無法在其上維持長(zhǎng)時(shí)間的生長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明首先提供了一種間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，使用無血清培養(yǎng)基對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；

所述無血清培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加成分，其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為IMDM培養(yǎng)基；