[發(fā)明專利]一種探針法定量檢測水產養(yǎng)殖環(huán)境中副溶血弧菌的檢測方法

在審

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• 申請日: 2020-12-18
• 公開（公告）號: CN112501327A
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發(fā)明（設計）人: 潘潔茹;江小斌;葉海梅;張善霹;蔡雷鳴;劉杰;郭睿;王偉
• 申請（專利權）人: 福州市疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/06;C12R1/63
• 代理公司: 廣東有知貓知識產權代理有限公司 44681
• 代理人: 胡強

本發(fā)明公開了一種Taqman探針法定量檢測水產養(yǎng)殖環(huán)境中副溶血弧菌的檢測方法。本發(fā)明方法利用副溶血性弧菌不耐熱性溶血毒素(Tlh)基因的種屬特異性及其與副溶血性弧菌本身數(shù)量的線性關系特點，運用分子克隆技術將Tlh基因與克隆載體連接，制備出五個不同濃度的陽性定量參考品；運用本發(fā)明的Taqman探針熒光定量PCR法和傳統(tǒng)菌落計數(shù)方法同時定量檢測不同養(yǎng)殖環(huán)境樣品，結果顯示本發(fā)明所述的方法與傳統(tǒng)菌落計數(shù)法對副溶血弧菌的定量結果沒有顯著性差異；同時Taqman探針法定量檢測副溶血弧菌特異性強，結果可靠，適用于定量檢測養(yǎng)殖場水體環(huán)境中副溶血性弧菌。

技術領域

本發(fā)明屬于環(huán)境樣品及食品檢驗檢疫和分子生物學檢測領域，具體涉及一種探針法定量檢測水產養(yǎng)殖環(huán)境中副溶血弧菌的檢測方法，特別是涉及一種針對海洋、水產養(yǎng)殖場等環(huán)境樣品中的副溶血性弧菌的基于Taqman探針熒光PCR定量檢測方法。

背景技術

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一種革蘭氏陰性嗜鹽性細菌，廣泛分布于海洋、鹽湖及海產品養(yǎng)殖場等環(huán)境中，如果污染海魚、蝦、貝類和蝦等海產品，食用后將引起急性胃腸炎，臨床癥狀包括腹瀉、嘔吐、惡心，腹部絞痛，低燒，寒戰(zhàn)等，沿海地區(qū)近50％以上的食物中毒由副溶血性弧菌引起，是一種重要的食源性致病菌。福州作為東南沿海城市，海洋漁業(yè)經濟蓬勃發(fā)展，擁有眾多海蠣、蝦、鮑魚等水產養(yǎng)殖場。在養(yǎng)殖過程中，水環(huán)境中的副溶血性弧菌的菌濃度對海產品是否致病及是否引起食源性疾病至關重要。建立養(yǎng)殖水體環(huán)境的副溶血性弧菌定量檢測方法，實施定期水樣監(jiān)測，對于保障海產品安全具有重要的現(xiàn)實意義。

利用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法對樣品中的副溶血性弧菌進行定量檢測，操作繁瑣，耗時長，十分不便。隨著分子生物學的發(fā)展，實時熒光定量PCR技術(qPCR技術)已廣泛地應用于各種細菌和病毒的檢測。雖然該方法具有耗時短、操作簡便、特異性和靈敏性高等特點，但常規(guī)qPCR檢測只用于食品及環(huán)境樣品的定性檢測，無法對標本進行定量，為此，提出一種探針法定量檢測水產養(yǎng)殖環(huán)境中副溶血弧菌的檢測方法。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種探針法定量檢測水產養(yǎng)殖環(huán)境中副溶血弧菌的檢測方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：一種探針法定量檢測水產養(yǎng)殖環(huán)境中副溶血弧菌的檢測方法，包括以下步驟：

S1、將副溶血性弧菌的Tlh基因與載體連接，制備不同濃度的陽性定量參考品，利用定量參考品做標準曲線；

S2、培養(yǎng)副溶血性弧菌標準菌株，制備成不同濃度的菌懸液樣品，分別提取DNA，與陽性定量參考品同時進行Taqman探針熒光定量PCR檢測，通過標準曲線的回歸方程計算出不同樣品副溶血性弧菌的濃度，同時對不同濃度的菌懸液樣品采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法進行菌落計數(shù)；

S3、探討兩種定量檢測方法的相關性，比較兩者結果的差異性，完成對水產養(yǎng)殖環(huán)境中副溶血弧菌的檢測。

優(yōu)選的：在S1中，將副溶血性弧菌的Tlh基因與載體連接，制備成5個不同梯度定量參考品，濃度分別為：10⁸copies/ml、10⁷copies/ml、10⁶copies/ml、10⁵copies/ml、10⁴copies/ml。

優(yōu)選的：在S2中，對DNA進行提取時，吸取不同濃度的樣品0.95-1.05mL，11500-12500rpm/min離心0.9-1.1分鐘，棄上清，加DNA提取液95-105μL，100℃加熱9.5-10.5分鐘，11500-12500rpm/min離心0.9-1.1分鐘，取上清為樣品模板。

優(yōu)選的：在與陽性定量參考品同時進行Taqman探針熒光定量PCR檢測時，使用熒光定量PCR儀針對副溶血弧菌Tlh基因進行實時熒光PCR檢測。

優(yōu)選的：熒光定量PCR反應體系中引物為F1(上游):