[發明專利]一種探針法定量檢測水產養殖環境中副溶血弧菌的檢測方法

在審

• 申請號: 202011505402.9
• 申請日: 2020-12-18
• 公開（公告）號: CN112501327A
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 潘潔茹;江小斌;葉海梅;張善霹;蔡雷鳴;劉杰;郭睿;王偉
• 申請（專利權）人: 福州市疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/06;C12R1/63
• 代理公司: 廣東有知貓知識產權代理有限公司 44681
• 代理人: 胡強

1.一種探針法定量檢測水產養殖環境中副溶血弧菌的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、將副溶血性弧菌的Tlh基因與載體連接，制備不同濃度的陽性定量參考品，利用定量參考品制做標準曲線；

S2、針對Tlh基因中的一個特異位點設計了一對特異性引物及Taqman探針，特異檢測副溶血性弧菌，溶藻弧菌、霍亂弧菌、創傷弧菌、坎氏弧菌、河弧菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、嗜水氣單胞菌等水產養殖環境常見菌株不會被檢測；

S3、提取不同水產養殖環境樣品總DNA，與陽性定量參考品同時進行Taqman探針熒光定量PCR檢測，通過標準曲線的回歸方程計算出不同樣品副溶血性弧菌的濃度；

S4、初次使用本發明方法可以同時對不同濃度的菌懸液樣品采用傳統培養法進行菌落計數，探討兩種定量檢測方法的相關性，比較兩者結果的差異性，完成對水產養殖環境中副溶血弧菌的檢測。

2.根據權利要求1所述的一種探針法定量檢測水產養殖環境中副溶血弧菌的檢測方法，其特征在于：在S1中，將副溶血性弧菌的Tlh基因與載體連接，制備成5個不同梯度定量參考品，濃度分別為：108copies/ml、107/ml copies/ml、106copies/ml、105copies/ml、104copies/ml。

3.根據權利要求1所述的一種探針法定量檢測水產養殖環境中副溶血弧菌的檢測方法，其特征在于：在S2中，對DNA進行提取時，需對樣品定量或定容，樣品均質處理盡量采用拍打式均質設備或方法以減少誤差，并使用商品化核酸提取試劑盒或核酸提取儀提取總DNA。

4.根據權利要求2所述的一種探針法定量檢測水產養殖環境中副溶血弧菌的檢測方法，其特征在于：在與陽性定量參考品同時進行Taqman探針熒光定量PCR檢測時，使用熒光定量PCR儀針對副溶血弧菌Tlh基因進行實時熒光PCR檢測。

5.根據權利要求4所述的一種探針法定量檢測水產養殖環境中副溶血弧菌的檢測方法，其特征在于：熒光定量PCR反應體系中引物為tlh F1(上游):CATCACGTTGTTTGATACTCAC，R1(下游)：GTTGATGTCCAAACAAGGATC,探針：CTGGCGCAGAAGTTAGCGTCT，其中所述探針的5端標記有熒光發生基團、3端標記有熒光淬滅基團。

6.根據權利要求5所述的一種探針法定量檢測水產養殖環境中副溶血弧菌的檢測方法，其特征在于：所述熒光發生基團為FAM，所述熒光淬滅基團為BQ1。

7.根據權利要求5所述的一種探針法定量檢測水產養殖環境中副溶血弧菌的檢測方法，其特征在于：在使用熒光定量PCR試劑檢測時，熒光PCR檢測的反應體系包括：無核酸酶水5.5-6.5μL，2×核酸擴增反應液9.5-10.5μL，10×引物探針反應液1.9-2.1μL，DNA模板1.9-2.1μL，熒光PCR檢測的反應程序為94-96℃，時間5min；94-96℃，時間15s，59-61℃，時間30s，40個循環，且于60℃進行FAM通道的熒光信號檢測。

8.根據權利要求1所述的一種探針法定量檢測水產養殖環境中副溶血弧菌的檢測方法，其特征在于：在S3中，對兩種定量檢測方法的差異性進行記錄。