[發明專利]一種膠體金間接標記、封閉的方法

有效

• 申請號: 202011504889.9
• 申請日: 2020-12-18
• 公開（公告）號: CN112649599B
• 公開（公告）日: 2022-08-16
• 發明（設計）人: 付清山;王米格;劉麗君;李靜輝;于林;劉功成;渠海;付光宇;吳學煒
• 申請（專利權）人: 鄭州安圖生物工程股份有限公司
• 主分類號: G01N33/532
• 分類號: G01N33/532;G01N33/543
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 王歡

本發明涉及生物分析檢測技術領域，尤其涉及一種膠體金間接標記、封閉的方法。該方法利用大分子封閉劑封閉后再利用小分子封閉劑封閉，使得膠體金表面的蛋白偶聯物穩定性得到明顯增強，利用該蛋白偶聯物進行免疫檢測可以有效提高偶聯效率、敏感性、穩定性。

技術領域

本發明涉及生物分析檢測技術領域，尤其涉及一種膠體金間接標記、封閉的方法。

背景技術

膠體金標記實質上是蛋白質等高分子直接被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機理是蛋白質等大分子經過一種或多種作用力和膠體金相互作用，形成相對穩定的復合物，這種作用力是靜電作用、疏水作用、金-巰基共價結合等。膠體金和大分子物質相互作用后，通常會用非目標蛋白例如BSA進行封閉，封閉后由于位阻作用，在膠體金的表面有很多空白的位點，這些空白位點會吸附蛋白以及特定的小分子物質，和已吸附的目標蛋白競爭，造成目標蛋白脫落，穩定性不好。利用膠體金和目標蛋白的復合物制備成膠體金產品，具有方便、快速、無需儀器等優點，在生物檢測領域得到了廣泛的應用。

申請號為201110044743.5的中國專利“一種膠體金標記方法”描述了通過改變標記緩沖液pH的辦法將蛋白直接標記在膠體金顆粒上，提升了穩定性和靈敏度。申請號為201310485455.2的中國專利“一種用于快速檢測的膠體金共價標記方法”描述的是將蛋白經過處理引入更多的巰基，經過金-巰基形成共價鍵，從而將蛋白共價偶聯在金顆粒表面。這2個專利，膠體金偶聯蛋白質的方法有一個共性就是通過目標蛋白和膠體金顆粒直接接觸吸附到膠體金顆粒表面，這種結合是無規則的吸附過程，蛋白和膠體金的空間距離非常小，并且非常容易在無規則吸附過程中屏蔽反應位點，造成標記蛋白反應性降低、標記效率不高。

申請號為201810498754.2的中國專利“一種膠體金利用標記羊抗鼠二抗后間接連接鼠抗標記的金標免疫層析試紙條的制備方法”描述了利用二抗和單抗在膠體金表面間接偶聯的方法。申請號為201811168958.6的中國專利“間接標記納米顆粒的抗體檢測捕獲法及其試劑盒”描述了利用標簽抗體在膠體金表面進行吸附，之后再進行標簽蛋白偶聯。上述兩個專利是在膠體金表面間接的標記蛋白，二者的共性是在膠體金表面間接的偶聯蛋白提升了反應性和特異性，同時在進行第一階段偶聯是非特異的物理吸附，第二階段是利用特異性反應間接的偶聯目標蛋白，第一步吸附后由于在膠體金的表面有很多空白的位點，這些位點會吸附非標記物質，和已吸附的目標蛋白競爭，造成目標蛋白脫落，穩定性不好。

申請號為202010403046.3的中國專利“特異性抗體的檢測標記物、其制備方法、其應用及試劑盒”描述了使用膠體金偶聯大分子后甘氨酸作為封閉劑使用。申請號為201210027887.4的中國專利“免疫膠體金試紙及其配合光電傳感器定量檢測CLB的方法”描述了使用脫脂奶粉和甘氨酸的混合物作為封閉劑使用。這些封閉劑的封閉效果均不理想，導致免疫檢測的偶聯效率低、穩定性差的問題。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種膠體金間接標記、封閉的方法。該方法利用大分子封閉劑封閉后再利用小分子封閉劑的封閉方法結合膠體金間接標記，使得膠體金表面的蛋白偶聯物穩定性得到明顯增強，利用該蛋白偶聯物進行免疫檢測可以有效提高偶聯效率、敏感性、穩定性。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供一種膠體金間接標記、封閉的方法，包括：

步驟1：獲得包被有第一偶聯物的膠體金顆粒，然后加入第一封閉液封閉，得復合物1；

步驟2：向膠體金-第一偶聯物-第一封閉劑復合物中加入第二封閉液封閉，得復合物2；

步驟3：向復合物2中加入第二偶聯物，獲得膠體金蛋白偶聯物；

所述第一封閉劑液由第一封閉劑和緩沖液組成，所述第一封閉劑選自BSA、Casein、孔藍蛋白、高PEG20000、PEG6000的一種或多種；