[發明專利]一種高效的酵母雙雜交三框文庫構建技術

在審

• 申請號: 202011504232.2
• 申請日: 2020-12-17
• 公開（公告）號: CN112575024A
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 李昆鵬;李敏
• 申請（專利權）人: 武漢金開瑞生物工程有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/66;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 武漢藍寶石專利代理事務所(特殊普通合伙) 42242
• 代理人: 劉璐

本發明涉及一種高效的酵母雙雜交三框文庫構建技術，包括用于高效酵母雙雜交三框文庫構建的重組載體，所述重組載體有三種，所述三種重組載體是在原始PGADT7載體分別插入堿基序列1、堿基序列2和堿基序列3構建而成，所述堿基序列1的核苷酸序列為SEQ ID NO：1，所述堿基序列2的核苷酸序列為SEQ ID NO：2，所述堿基序列3的核苷酸序列為SEQ ID NO：3。還包括上述載體的構建方法及利用上述載體構建酵母雙雜交三框文庫的構建方法。本發明通過重組載體構建酵母雙雜交三框文庫，能夠有效降低假陰性率，并且成本較為低廉。

技術領域

本發明屬生物技術領域，具體涉及一種高效的酵母雙雜交三框文庫構建技術。

背景技術

酵母雙雜交技術在研究兩個已知蛋白間相互作用以及利用酵母雙雜交技術高通量篩選已知獲得未知蛋白方面具有廣泛的用途，且近年來取得長足發展。酵母雙雜交技術的優化改進一直是為降低酵母雙雜交篩選的假陽性或者假陰性的產生而設計的。而文庫的質量是以上目的的達成關鍵。

Clontech公司研發的matplate文庫，在合適的選擇培養基上，將酵母獵物蛋白文庫和誘餌菌株通過mating的方式共培養篩選出與已知蛋白相互作用的獵物蛋白。其文庫構建的原理是利用了釀酒酵母體內本底的高效的同源重組機制。在Y187酵母菌內完成載體和雙鏈cDNA的同源重組。是一種高效的文庫構建篩選策略，但是由于酵母雙雜交篩選技術是在蛋白水平上研究兩個蛋白之間相互作用的。其構建的為表達文庫，被構建的雙鏈CDNA最終是需要翻譯成蛋白起到篩選作用的。上述文庫存在假陰性較高的問題。

因此開發一種高效的可以起修復矯正作用的三框文庫技術，增加文庫篩選的有效滴度，降低篩選的假陰性率是我們亟待解決的問題。

發明內容

本發明針對現有技術中存在的不足，提供一種高效的酵母雙雜交三框文庫構建技術，通過重組載體構建酵母雙雜交三框文庫，能夠有效降低假陰性率，并且成本較為低廉。

為解決上述問題，本發明的技術方案如下：

本發明保護一種用于高效酵母雙雜交三框文庫構建的重組載體，所述重組載體有三種，所述三種重組載體是在原始PGADT7載體分別插入堿基序列1、堿基序列2和堿基序列3構建而成，所述堿基序列1的核苷酸序列為SEQ ID NO：1，所述堿基序列2的核苷酸序列為SEQ ID NO：2，所述堿基序列3的核苷酸序列為SEQ ID NO：3。

本發明還保護上述用于高效酵母雙雜交三框文庫構建的重組載體的構建方法，包括以下步驟：

步驟1)，全基因合成堿基序列1、堿基序列2和堿基序列3，所述堿基序列1的核苷酸序列為SEQ ID NO：1，所述堿基序列2的核苷酸序列為SEQ ID NO：2，所述堿基序列3的核苷酸序列為SEQ ID NO：3；

步驟2)，SfiI單酶切原始PGADT7載體并回收酶切載體備用；

步驟3)，將步驟1)合成的堿基序列1、堿基序列2和堿基序列3連接到步驟2)得到的酶切載體中，得到三種重組載體。

在上述技術方案的基礎上，本發明還能夠有如下改進。

進一步，所述步驟2)中，用PCR產物回收試劑盒回收酶切載體。

本發明還保護采用上述重組載體的用于高效酵母雙雜交三框文庫的構建方法，包括以下步驟：

步驟a，雙鏈cDNA制備：提取總RNA，分離出mRNA，經逆轉錄PCR合成單鏈cDNA，再通過LD-PCR以單鏈cDNA擴增獲得雙鏈cDNA；

步驟b，構建重組載體：在原始PGADT7載體分別插入堿基序列1、堿基序列2和堿基序列3構建三種重組載體；