[發明專利]一種高效的酵母雙雜交三框文庫構建技術

在審

• 申請號: 202011504232.2
• 申請日: 2020-12-17
• 公開（公告）號: CN112575024A
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 李昆鵬;李敏
• 申請（專利權）人: 武漢金開瑞生物工程有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/66;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 武漢藍寶石專利代理事務所(特殊普通合伙) 42242
• 代理人: 劉璐

1.一種用于高效酵母雙雜交三框文庫構建的重組載體，其特征在于：所述重組載體有三種，所述三種重組載體是在原始PGADT7載體分別插入堿基序列1、堿基序列2和堿基序列3構建而成，所述堿基序列1的核苷酸序列為SEQ ID NO：1，所述堿基序列2的核苷酸序列為SEQ ID NO：2，所述堿基序列3的核苷酸序列為SEQ ID NO：3。

2.一種權利要求1所述用于高效酵母雙雜交三框文庫構建的重組載體的構建方法，其特征在于包括以下步驟：

步驟1)，全基因合成堿基序列1、堿基序列2和堿基序列3，所述堿基序列1的核苷酸序列為SEQ ID NO：1，所述堿基序列2的核苷酸序列為SEQ ID NO：2，所述堿基序列3的核苷酸序列為SEQ ID NO：3；

步驟2)，SfiI單酶切原始PGADT7載體并回收酶切載體備用；

步驟3)，將步驟1)合成的堿基序列1、堿基序列2和堿基序列3連接到步驟2)得到的酶切載體中，得到三種重組載體。

3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，所述步驟2)中，用PCR產物回收試劑盒回收酶切載體。

4.一種采用權利要求1所述重組載體的用于高效酵母雙雜交三框文庫的構建方法，其特征在于包括以下步驟：

步驟a，雙鏈cDNA制備：提取總RNA，分離出mRNA，經逆轉錄PCR合成單鏈cDNA，再通過LD-PCR以單鏈cDNA擴增獲得雙鏈cDNA；

步驟b，構建重組載體：在原始PGADT7載體分別插入堿基序列1、堿基序列2和堿基序列3構建三種重組載體；

步驟c，重組產物的制備，將步驟a得到的雙鏈cDNA與等摩爾比混合的步驟b得到的三種重組載體的酶切載體進行infusine體外同源重組反應，得到重組產物；

步驟d，轉化到大腸桿菌：將步驟c得到的重組產物轉化到新鮮制備的大腸桿菌感受態細胞DH10b；

步驟e，文庫測序鑒定。

5.根據權利要求4所述的用于高效酵母雙雜交三框文庫的構建方法，其特征在于，所述步驟a中，經LD-PCR后，還需要對PCR產物進行純化。

6.根據權利要求4所述的用于高效酵母雙雜交三框文庫的構建方法，其特征在于，所述步驟b中，所述雙鏈cDNA與等摩爾比混合的三種重組載體的酶切載體按照總摩爾比3:1的比例混合。