[發明專利]一種畢赤酵母重組菌、培養方法及用途

在審

• 申請號: 202011502087.4
• 申請日: 2020-12-18
• 公開（公告）號: CN112725211A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 彭志恩;宋浩;柳學偉;巨曉芝;楊曉瑜;郭萬成
• 申請（專利權）人: 奧銳特藥業（天津）有限公司;揚州聯澳生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/16;C12N15/81;C07K14/605;A61K38/26;A61P3/10;C12R1/84
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 裴金華

本發明公開了一種畢赤酵母重組菌、培養方法及用途，制備培養得到的重組酵母可高效表達GLP?1類似物，進而高效制備GLP?1類似物。

技術領域

本發明屬于工程菌技術領域，具體涉及一種畢赤酵母重組菌、培養方法及用途。

背景技術

人胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）在治療2型糖尿病中具有藥用潛力。GLP-1的多方面生理作用包括刺激胰島素表達、抑制胰高血糖素分泌和減少胃排空，有助于葡萄糖水平的正常化。隨著2型糖尿病在世界范圍內的流行率增加，開發了許多GLP-1衍生物以增強GLP-1的生物活性和藥物穩定性。其日益增長的需求要求開發利用重組微生物進行GLP-1及其類似物大規模生產的生物工藝。

CN1225126A公開了一種通過基因重組技術，利用釀酒酵母發酵表達GLP-1（7-37）的方法。該方法技術難度大，生產成本高，不利于大規模生產。

CN110128552A，CN110498849A，CN107881187A，CN104592381A，CN108191981A，CN10724187A，CN107881187A公開了大腸桿菌表達GLP-1類似物的方法，這些方法均會產生包涵體，需要進行酶切且分離純化復雜。

發明人通過篩選大量菌株后發現，選用畢赤酵母作為宿主有優勢：不同的蛋白酶有不同的最佳pH作用范圍，選擇適當的發酵pH可以不影響細胞的生長，并且可降低蛋白酶活性，減少目的蛋白的降解。畢赤酵母的pH適應范圍比較廣，可以在pH 3-7的范圍內生長。

CN103243118A公開了一種用畢赤酵母表達系統高效表達GLP-1人重組蛋白方法，包括載體構建和建立畢赤酵母表達GLP-1菌株，可得到99.9%純度的產品GLP-1表達蛋白約30mg/ml。但是根據畢赤酵母表達手冊，分泌蛋白占總蛋白的比例30%左右，如果發酵產量達到30g/L（30mg/ml），那么總蛋白表達量就要達到約100g/L，這都達到了高密度發酵細胞干重的重量了，而蛋白質只占細胞干重的一半左右。因此文中所述“最終產品GLP-1表達蛋白約30mg/ml”指的應該是分離純化濃縮后的產量，而不可能是發酵產量。

發明人在實驗研究中發現，雖然畢赤酵母的pH適應范圍比較廣，但畢赤酵母中的各種蛋白酶量會隨著發酵過程中營養條件的改變發生變化，如發酵過程中的碳源改變、溫度和pH變化及有害產物的形成等。在發酵過程中，由于高密度細胞的影響以及部分細胞的裂解，液泡中的蛋白酶常釋放到培養基中，隨著外源蛋白在培養基中的濃度不斷提高，蛋白水解酶濃度也隨著升高，導致目的蛋白的降解。因此，想要提高外源蛋白的產量，必須防止蛋白水解酶的水解作用，提高外源蛋白的穩定性，減少外源蛋白的損失。

發明內容

針對上述存在的問題，本發明的第一目的是提供一種畢赤酵母重組菌，可高效表達GLP-1類似物，且能確保外源蛋白的穩定性。

為了實現上述目的，本發明的技術方案如下：

一種畢赤酵母重組菌，包含表達合成GLP-1類似物的表達系統，所述GLP-1類似物的形式包括：GLP-1截短和/或N-末端延伸的形式和/或部分氨基酸突變形式，如Arg³⁴GLP-1_（7-37）、Arg³⁴GLP-1_（9-37）。