[發(fā)明專利]一種畢赤酵母重組菌、培養(yǎng)方法及用途

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011502087.4
• 申請(qǐng)日: 2020-12-18
• 公開（公告）號(hào): CN112725211A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 彭志恩;宋浩;柳學(xué)偉;巨曉芝;楊曉瑜;郭萬(wàn)成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 奧銳特藥業(yè)（天津）有限公司;揚(yáng)州聯(lián)澳生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N15/16;C12N15/81;C07K14/605;A61K38/26;A61P3/10;C12R1/84
• 代理公司: 浙江千克知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33246
• 代理人: 裴金華

本發(fā)明公開了一種畢赤酵母重組菌、培養(yǎng)方法及用途，制備培養(yǎng)得到的重組酵母可高效表達(dá)GLP?1類似物，進(jìn)而高效制備GLP?1類似物。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于工程菌技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種畢赤酵母重組菌、培養(yǎng)方法及用途。

背景技術(shù)

人胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）在治療2型糖尿病中具有藥用潛力。GLP-1的多方面生理作用包括刺激胰島素表達(dá)、抑制胰高血糖素分泌和減少胃排空，有助于葡萄糖水平的正常化。隨著2型糖尿病在世界范圍內(nèi)的流行率增加，開發(fā)了許多GLP-1衍生物以增強(qiáng)GLP-1的生物活性和藥物穩(wěn)定性。其日益增長(zhǎng)的需求要求開發(fā)利用重組微生物進(jìn)行GLP-1及其類似物大規(guī)模生產(chǎn)的生物工藝。

CN1225126A公開了一種通過基因重組技術(shù)，利用釀酒酵母發(fā)酵表達(dá)GLP-1（7-37）的方法。該方法技術(shù)難度大，生產(chǎn)成本高，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。

CN110128552A，CN110498849A，CN107881187A，CN104592381A，CN108191981A，CN10724187A，CN107881187A公開了大腸桿菌表達(dá)GLP-1類似物的方法，這些方法均會(huì)產(chǎn)生包涵體，需要進(jìn)行酶切且分離純化復(fù)雜。

發(fā)明人通過篩選大量菌株后發(fā)現(xiàn)，選用畢赤酵母作為宿主有優(yōu)勢(shì)：不同的蛋白酶有不同的最佳pH作用范圍，選擇適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵pH可以不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且可降低蛋白酶活性，減少目的蛋白的降解。畢赤酵母的pH適應(yīng)范圍比較廣，可以在pH 3-7的范圍內(nèi)生長(zhǎng)。

CN103243118A公開了一種用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)GLP-1人重組蛋白方法，包括載體構(gòu)建和建立畢赤酵母表達(dá)GLP-1菌株，可得到99.9%純度的產(chǎn)品GLP-1表達(dá)蛋白約30mg/ml。但是根據(jù)畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)，分泌蛋白占總蛋白的比例30%左右，如果發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到30g/L（30mg/ml），那么總蛋白表達(dá)量就要達(dá)到約100g/L，這都達(dá)到了高密度發(fā)酵細(xì)胞干重的重量了，而蛋白質(zhì)只占細(xì)胞干重的一半左右。因此文中所述“最終產(chǎn)品GLP-1表達(dá)蛋白約30mg/ml”指的應(yīng)該是分離純化濃縮后的產(chǎn)量，而不可能是發(fā)酵產(chǎn)量。

發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，雖然畢赤酵母的pH適應(yīng)范圍比較廣，但畢赤酵母中的各種蛋白酶量會(huì)隨著發(fā)酵過程中營(yíng)養(yǎng)條件的改變發(fā)生變化，如發(fā)酵過程中的碳源改變、溫度和pH變化及有害產(chǎn)物的形成等。在發(fā)酵過程中，由于高密度細(xì)胞的影響以及部分細(xì)胞的裂解，液泡中的蛋白酶常釋放到培養(yǎng)基中，隨著外源蛋白在培養(yǎng)基中的濃度不斷提高，蛋白水解酶濃度也隨著升高，導(dǎo)致目的蛋白的降解。因此，想要提高外源蛋白的產(chǎn)量，必須防止蛋白水解酶的水解作用，提高外源蛋白的穩(wěn)定性，減少外源蛋白的損失。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述存在的問題，本發(fā)明的第一目的是提供一種畢赤酵母重組菌，可高效表達(dá)GLP-1類似物，且能確保外源蛋白的穩(wěn)定性。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種畢赤酵母重組菌，包含表達(dá)合成GLP-1類似物的表達(dá)系統(tǒng)，所述GLP-1類似物的形式包括：GLP-1截短和/或N-末端延伸的形式和/或部分氨基酸突變形式，如Arg³⁴GLP-1_（7-37）、Arg³⁴GLP-1_（9-37）。