[發明專利]一種丁香假單胞菌豌豆致病變種微滴式數字PCR分子檢測方法在審
| 申請號： | 202011498184.0 | 申請日： | 2020-12-17 |
| 公開（公告）號： | CN112410448A | 公開（公告）日： | 2021-02-26 |
| 發明（設計）人： | 許萍萍;李彬;楊靜;錢茱希;劉曉宇;周密密;何丹軍;吳翠萍 | 申請（專利權）人： | 中華人民共和國金陵海關 |
| 主分類號： | C12Q1/689 | 分類號： | C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/04;C12N15/11 |
| 代理公司： | 南京匯盛專利商標事務所(普通合伙) 32238 | 代理人： | 袁靜 |
| 地址： | 210000 江蘇*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 丁香 假單胞菌 豌豆 致病 變種 微滴式 數字 pcr 分子 檢測 方法 | ||
1.用于丁香假單胞菌豌豆致病變種的組合物，其特征在于包括組合物1和組合物2，所述組合物1含有引物A1F、A1R和探針AP1，所述組合物2含有引物B3F、B3R和探針BP3；所述引物A1F、A1R的序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，TaqMan探針AP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，TaqMan探針AP1的5’端結合有熒光發光基團FAM，3’端結合有熒光猝滅基團TAMRA；引物B3F、B3R的序列分別如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示，TaqMan探針BP3的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，TaqMan探針BP3的5’端結合有熒光發光基團FAM，3’端結合有熒光猝滅基團TAMRA。
2.根據權利要求1所述組合物，其特征在于丁香假單胞菌豌豆致病變種包括I群和II群。
3.一種丁香假單胞菌豌豆致病變種微滴式數字PCR分子檢測方法，其特征包含如下步驟：
(1)將豌豆樣品采用生理鹽水浸泡過夜，離心取沉淀，提取基因組DNA；
(2)以所述基因組DNA為模板，采用引物B3F、B3R和探針BP3進行微滴式數字PCR檢測；若陽性微滴數大于0，則待測樣品中含有丁香假單胞菌豌豆致病變種；若陽性微滴數小于或等于0，則進行步驟(3)；
(3)以所述基因組DNA為模板，采用引物A1F、A1R和探針AP1進行微滴式數字PCR檢測；若陽性微滴數大于0，則待測樣品中含有丁香假單胞菌豌豆致病變種；若陽性微滴數小于或等于0，則樣品中無丁香假單胞菌豌豆致病變種。
4.根據權利要求3所述丁香假單胞菌豌豆致病變種微滴式數字PCR分子檢測方法，其特征在于微滴式數字PCR檢測中的反應體系包括：10μL的ddPCR supermix(2×)、0.4μL的上游引物、0.4μL的下游引物、0.2μL的TaqMan探針、2μL基因組DNA和7μL的ddH2O。
5.根據權利要求4所述檢測方法，其特征在于微滴式數字PCR檢測中的反應條件為：95℃預變性10min；94℃變性30s，60度退火及延伸60s，共40個循環；98℃固化微滴10min。
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