[發明專利]一種丁香假單胞菌豌豆致病變種微滴式數字PCR分子檢測方法

在審

• 申請號: 202011498184.0
• 申請日: 2020-12-17
• 公開（公告）號: CN112410448A
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發明（設計）人: 許萍萍;李彬;楊靜;錢茱希;劉曉宇;周密密;何丹軍;吳翠萍
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國金陵海關
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 南京匯盛專利商標事務所(普通合伙) 32238
• 代理人: 袁靜

本發明提供一種丁香假單胞菌豌豆致病變種微滴式數字PCR分子檢測方法，屬于生物技術領域。該檢測方法使用引物A1F、A1R和探針AP1，引物B3F、B3R和探針BP3。引物A1F、A1R的序列如SEQ ID NO:1?2所示，TaqMan探針AP1的序列如SEQ ID NO:3所示，引物B3F、B3R的序列如SEQ ID NO:4?5所示，TaqMan探針BP3的序列如SEQ ID NO:6所示，AP1和BP3的5’端均結合有熒光發光基團FAM，3’端均結合有熒光猝滅基團TAMRA。本發明檢測方法，可快速、靈敏、準確、高特異性地對口岸進口的豌豆種子進行丁香假單胞菌豌豆致病變種的檢測。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種丁香假單胞菌豌豆致病變種微滴式數字PCR分子檢測方法。

背景技術

豌豆細菌性疫病的病原菌為丁香假單胞菌豌豆致病變種(Pseudomonas syringaepv.pisi)，屬于薄壁菌門(Gracilicutes)假單胞菌科(Pseudomonadaceae)假單胞菌屬(Pseudomonas)丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)的致病變種，革蘭氏陰性菌。該病菌主要寄主為豌豆(Pisum sativum)，自然條件下也可侵染扁豆(Lablab purpureus)、山黧豆(Lathyrus odoratus)、寬葉山黧豆(L.latifolius)、野豌豆屬(Vicia spp.)和孟加拉野豌豆(V.benghalensis)。該病菌可引起寄主植物花梗、花和豆莢等萎蔫枯死，導致植株猝倒，早期侵染可造成嚴重損失，對產量影響較大。

豌豆細菌性疫病為我國禁止進境植物檢疫性細菌病害，1915年首次報道在美國科羅拉多州發生,隨后該病害迅速擴散至世界各豌豆重要生產區，我國尚無分布。

豌豆細菌性疫病菌主要隨種子進行遠距離傳播，病菌在種子表面或種子內部可存活數個生長季節，經表面藥劑處理后的種子內部仍有病菌存活，因此極難防治。

豌豆是我國第一大食用豆進口品種，中國是全球第二大進口國，加拿大、美國是我國的豌豆主要進口國。豌豆細菌性疫病在加拿大廣泛分布，美國的加利福利亞州、科羅拉多州、堪薩斯州、紐約州、華盛頓州、威斯康辛州均有分布。海關從加拿大進口豌豆中多次檢出過該病菌，因此，該病菌隨進口豌豆等大宗農產品傳入、定殖和擴散的可能性都很大，并可隨種子的調運在國內傳播。因此，豌豆細菌性疫病病原菌已成為我國豌豆生產潛在的巨大威脅。

丁香假單胞菌P.syringae寄主范圍廣，常見的致病變種已達60多種，種內致病變種的區分和鑒定一直是植物病原細菌鑒定中的難點。因寄主范圍相近，在對進口豌豆疫情檢測中，丁香假單胞菌豌豆致病變種與丁香致病變種、菜豆變種、大豆變種常常并存，難以區分。同時，丁香假單胞菌豌豆致病變種根據8個不同豌豆栽培種無毒基因(A)與抗性基因(R)的相互作用被分為8個生理小種。根據病原菌特異性片段，并以此設計引物進行PCR擴增，8個生理小種分別擴增出272bp或132bp片段，因此將8個生理小種分為兩個系統發育群，I群為1、3B、4B、5、7生理小種，II群為2、3A、4A、6、8生理小種。從現有研究資料來看，II群相對來說更常見。對致病變種的鑒定，采用生理生化方法耗費時間較長，同時一些理化鑒定結果易于因為主觀上的差異從而不能客觀反應不同致病變種之間的差異。近些年，在分子生物學檢測方法上，進行了較多的嘗試，但存在特異性不足、耗時較長等問題。

發明內容

本發明的目的是提供一種丁香假單胞菌豌豆致病變種微滴式數字PCR分子檢測方法，可快速、靈敏、準確、高特異性地對口岸進口的豌豆種子進行丁香假單胞菌豌豆致病變種的檢測。

本發明的目的采用如下技術方案實現：