[發(fā)明專利]一種基于絕跡稀釋培養(yǎng)組的功能微生物高通量分析和選育方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011492682.4
• 申請(qǐng)日: 2020-12-16
• 公開（公告）號(hào): CN112662727A
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許玫英;鄧通初;郭俊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東省科學(xué)院微生物研究所（廣東省微生物分析檢測(cè)中心）
• 主分類號(hào): C12Q1/04
• 分類號(hào): C12Q1/04;C12Q1/6869;C12Q1/689
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星;朱聰聰

本發(fā)明公開了一種基于絕跡稀釋培養(yǎng)組的功能微生物高通量分析和選育方法。本發(fā)明能從環(huán)境樣品中，特別是如土壤和沉積物等復(fù)雜的環(huán)境體系中，經(jīng)過梯度稀釋，在不同的稀釋度下富集出不同功能活性特征的微生物群落；對(duì)這些群落進(jìn)行高通量測(cè)序，分析其結(jié)構(gòu)組成。再根據(jù)這些群落的組成特征，針對(duì)出現(xiàn)的不同種類微生物，設(shè)計(jì)分離培養(yǎng)基進(jìn)行分離篩選。該方法通過稀釋培養(yǎng)過程，能有效分離環(huán)境中不同豐度和不同功能特征的物種，不僅能獲得相對(duì)豐度高的物種，也能利于分離相對(duì)豐度較低的稀有物種。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于絕跡稀釋培養(yǎng)組的功能微生物高通量分析和選育方法。

背景技術(shù)：

高通量測(cè)序技術(shù)和宏基因組學(xué)的出現(xiàn)和發(fā)展，使我們認(rèn)識(shí)到目前已經(jīng)分離培養(yǎng)的微生物僅僅是一小部分，環(huán)境中超過99％的微生物都仍然未實(shí)現(xiàn)純培養(yǎng)。這些未培養(yǎng)的微生物雖然已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，但是高通量測(cè)序獲得的信息非常有限，我們很難通過核酸序列信息獲知相應(yīng)物種的功能和表型信息，以及它在環(huán)境中的生態(tài)作用。此外，生態(tài)系統(tǒng)中存在著許多低豐度的稀有物種，這些稀有物種是多樣性的重要組成部分。在條件合適時(shí)，這些物種可能迅速響應(yīng)，對(duì)推動(dòng)元素循環(huán)和物質(zhì)轉(zhuǎn)化以及維持生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性發(fā)揮著重要的作用。但是，由于高通量測(cè)序技術(shù)自帶的多個(gè)步驟的抽樣過程，具有一定的檢測(cè)下限，很難檢測(cè)到這些稀有物種的存在，更難于研究它們的功能。因此，基于目前高通量測(cè)序等技術(shù)手段很難對(duì)環(huán)境中微生物的多樣性和功能有全面的認(rèn)識(shí)。大量功能未知的未培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)難和低豐度稀有物種的測(cè)定難是限制微生物生態(tài)學(xué)發(fā)展的瓶頸。

近年來，培養(yǎng)組學(xué)概念的興起為未培養(yǎng)微生物的挖掘和功能研究提供了新思路。培養(yǎng)組學(xué)是通過多種培養(yǎng)條件對(duì)目標(biāo)微生物進(jìn)行培養(yǎng)，并利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)和16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)對(duì)它們進(jìn)行高通量鑒定的一種培養(yǎng)技術(shù)。通過培養(yǎng)組，許多研究在人體微生物群，特別是腸道微生物群中分離培養(yǎng)了大量的新型微生物，更新了我們對(duì)人體微生物組的認(rèn)識(shí)。將培養(yǎng)組運(yùn)用于微生物生態(tài)學(xué)研究中，將與高通量測(cè)序技術(shù)等非培養(yǎng)技術(shù)形成有效的互補(bǔ)，更加準(zhǔn)確的闡明微生物生態(tài)學(xué)中的問題。培養(yǎng)組技術(shù)的特征在于對(duì)微生物的高通量鑒定上，而對(duì)于環(huán)境中特殊類群的微生物仍然需要結(jié)合不同的培養(yǎng)方法對(duì)不同的微生物種類進(jìn)行分離。然而，目前對(duì)于環(huán)境中目標(biāo)功能微生物類群的選育，仍然缺乏較好的方法。尤其是環(huán)境中相對(duì)豐度較低的功能物種的選育。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是提供一種基于絕跡稀釋培養(yǎng)組的功能微生物高通量分析和選育方法，其能有效分離環(huán)境中不同豐度和不同功能特征的物種。

本發(fā)明的基于絕跡稀釋培養(yǎng)組的功能微生物高通量分析和選育方法，包括以下步驟：

a、利用含底物的選擇性培養(yǎng)基對(duì)環(huán)境樣品進(jìn)行多個(gè)系列的梯度稀釋；

b、將梯度稀釋的樣品進(jìn)行培養(yǎng)，并測(cè)定選擇性培養(yǎng)基中底物的濃度變化情況；

c、選擇降解底物最多的、活性的最高的若干個(gè)稀釋度的樣品組成絕跡稀釋培養(yǎng)組，然后收集菌體，按照統(tǒng)一的生物量接種到新鮮的含底物的選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，再測(cè)定底物的變化情況，利用底物的變化率反映絕跡稀釋培養(yǎng)組不同樣品的潛在活性；

d、收集步驟c測(cè)定潛在活性后的樣品中的菌體，提取總DNA，并擴(kuò)增16S rRNA基因V4-V5區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序，利用生物信息學(xué)方法分析絕跡稀釋培養(yǎng)組樣品微生物群落的物種組成，及其與潛在活性特征的關(guān)系；

e、根據(jù)絕跡稀釋培養(yǎng)組樣品的微生物群落組成特征，選取樣品先用固體富集培養(yǎng)基對(duì)目標(biāo)功能物種進(jìn)行單菌落分離篩選，純化，并進(jìn)行物種鑒定和功能鑒定，驗(yàn)證是否分離到目標(biāo)功能物種。