[發明專利]一種基于絕跡稀釋培養組的功能微生物高通量分析和選育方法

在審

• 申請號: 202011492682.4
• 申請日: 2020-12-16
• 公開（公告）號: CN112662727A
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發明（設計）人: 許玫英;鄧通初;郭俊
• 申請（專利權）人: 廣東省科學院微生物研究所（廣東省微生物分析檢測中心）
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12Q1/6869;C12Q1/689
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星;朱聰聰

1.一種基于絕跡稀釋培養組的功能微生物高通量分析和選育方法，其特征在于，包括以下步驟：

a、利用含底物的選擇性培養基對環境樣品進行多個系列的梯度稀釋；

b、將梯度稀釋的樣品進行培養，并測定選擇性培養基中底物的濃度變化情況；

c、選擇降解底物最多的、活性的最高的若干個稀釋度的樣品組成絕跡稀釋培養組，然后收集菌體，按照統一的生物量接種到新鮮的含底物的選擇性培養基上進行培養，再測定底物的變化情況，利用底物的變化率反映絕跡稀釋培養組不同樣品的潛在活性；

d、收集步驟c測定潛在活性后的樣品中的菌體，提取總DNA，并擴增16S rRNA基因V4-V5區進行高通量測序，利用生物信息學方法分析絕跡稀釋培養組樣品微生物群落的物種組成，及其與潛在活性特征的關系；

e、根據絕跡稀釋培養組樣品的微生物群落組成特征，選取樣品先用固體富集培養基對目標功能物種進行單菌落分離篩選，純化，并進行物種鑒定和功能鑒定，驗證是否分離到目標功能物種。

2.根據權利要求1所述的基于絕跡稀釋培養組的功能微生物高通量分析和選育方法，其特征在于，所述的含底物的選擇性培養基中的底物是Na₂S，來篩選硝酸鹽還原硫氧化細菌；或以NaS₂O₃作為底物，來篩選氧化硫代硫酸鹽的細菌。

3.根據權利要求1所述的基于絕跡稀釋培養組的功能微生物高通量分析和選育方法，其特征在于，所述的環境樣品是土壤樣品、沉積物樣品或水樣品。

4.根據權利要求1所述的基于絕跡稀釋培養組的功能微生物高通量分析和選育方法，其特征在于，所述的梯度稀釋是：取1g或者1ml環境樣品到10ml離心管中，加入9ml培養基，定義為10^-1稀釋度樣品；再從10^-1稀釋度取1ml混合液到第二個10ml離心管，加入9ml培養基，定義為10^-2稀釋度樣品；再從10^-2稀釋度取1ml混合液到第三個10ml離心管，加入9ml培養基，定義為10^-3稀釋度樣品；重復類似的稀釋操作，直到10^-8稀釋度。

5.根據權利要求1所述的基于絕跡稀釋培養組的功能微生物高通量分析和選育方法，其特征在于，所述的選擇降解底物最多的、活性的最高的若干個稀釋度的樣品組成絕跡稀釋培養組是選擇降解底物最多的、活性的最高的3-4個稀釋度的樣品組成絕跡稀釋培養組。

6.根據權利要求1所述的基于絕跡稀釋培養組的功能微生物高通量分析和選育方法，其特征在于，還可以根據絕跡稀釋培養組中各個物種分別達到的最高稀釋度，分別根據公式“物種個數/每克干沉積物＝(最高位數稀釋度稀釋倍數/沉積物干重所占質量分數)”估算這些物種在原環境樣品中的絕對豐度。

7.根據權利要求1、2、3、4、5或6所述的基于絕跡稀釋培養組的功能微生物高通量分析和選育方法，其特征在于，所述的步驟e的物種鑒定是利用菌落PCR擴增16S rRNA基因進行初步物種鑒定，驗證是否分離到目標物種，對于群落中無法獲得的一些物種，根據物種的種屬信息設計培養基進一步嘗試分離，同時也進一步劃線純化和鑒定。