[發明專利]一種寡核苷酸、載體及制備方法和應用

有效

• 申請號: 202011492355.9
• 申請日: 2020-12-17
• 公開（公告）號: CN112574991B
• 公開（公告）日: 2023-03-17
• 發明（設計）人: 沈小鵬;張靜宜;畢超;朱國萍;王敖;李蒙;劉忠賢;王春光
• 申請（專利權）人: 安徽師范大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;C12N15/85;A61K31/713;A61P21/00
• 代理公司: 南京匠橋專利代理有限公司 32568
• 代理人: 陳秀芳

本發明提供了一種寡核苷酸、載體及制備方法和應用，所述寡核苷酸的正義鏈核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反義鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本發明通過設計研究，成功構建出了用于下調Postn表達量的寡核苷酸。首次利用寡核苷酸分子修復強直性肌營養不良I型的成肌障礙，該寡核苷酸分子通過下調DM1疾病細胞模型中的Postn蛋白表達量，從而達到修復成肌功能障礙的目的。

技術領域

本發明涉及基因治療技術領域，尤其涉及一種寡核苷酸、載體及制備方法和應用。

背景技術

強直性肌營養不良I型(myotonic dystrophy type 1，DM1)是一種以進行性肌無力、肌萎縮和肌強直為主要特點的常染色體顯性遺傳疾病，也是成人骨骼肌發育過程中最為常見的肌營養不良疾病，發病率約在1/8000至1/7000之間。DM1是由位于DMPK基因3’非翻譯區(3’UTR)的過度擴增的三核苷酸(CTG)重復序列導致的。過度擴增的三核苷酸(CTG)重復序列轉錄生成含有過度擴增CUG重復序列的“毒性RNA”，導致游離的MBNL1減少和Celf1水平的上調。MBNL1和Celf1水平的改變導致細胞內相關基因可變剪切模式的改變，從而導致DM1癥狀的發生。DM1中的成肌過程受阻是導致DM1骨骼肌病癥的主要原因之一，主要表現為成肌細胞的分化能力顯著喪失和成肌細胞的融合能力明顯下降。目前，DM1中成肌功能障礙的機理雖已經有一些研究，但尚有爭議。相應的，特異性的針對DM1成肌功能障礙的治療靶點和方法也幾乎未見報道。

目前臨床上還沒有根治DM1的方法，僅有一些基于DM1致病機理提出的治療猜想，主要包括如下三種：第一種是通過恢復DM1中MBNL1和Celf1的水平以修正DM1中錯誤的基因剪切模式；第二種是運用多肽或化學小分子有機物等分子降解毒性RNA；第三種是運用基因編輯的手段切掉基因組上編碼毒性RNA的片段。這三種治療猜想的效果評估和臨床測試尚在進行中，安全性未知。并且上述治療猜想皆不是特異性地針對DM1中成肌功能障礙提出的，因此找到特異性DM1成肌功能障礙的治療靶點和治療策略對于恢復DM1中骨骼肌功能缺陷十分必要。

發明內容

本發明旨在解決現有技術中存在的技術問題。為此，本發明提供一種寡核苷酸、載體及制備方法和應用，目的是用以下調DM1疾病細胞模型中的Postn蛋白表達量，從而達到修復成肌功能障礙的目的。

基于上述目的，本發明提供了一種寡核苷酸，所述寡核苷酸的正義鏈核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反義鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述寡核苷酸的制備方法，包括如下步驟：

步驟一、選取作用于Postn的mRNA上2063-2085區域的siRNA分子，得到siRNA的正義鏈序列與反義鏈序列；

步驟二、將步驟一得到的siRNA的正義鏈序列與反義鏈序列置于寡核苷酸模板中，獲得寡核苷酸的正義鏈核苷酸序列和反義鏈的核苷酸序列；

步驟三、將寡核苷酸的正義鏈核苷酸序列和反義鏈的核苷酸序列經退火融合成雙鏈、一次孵育、加入10mM ATP及10U/uL T4 Kinase繼續二次孵育后得到。

所述步驟一中siRNA的正義鏈序列如SEQ ID NO.1所示與反義鏈序列如SEQ IDNO.2所示。

此siRNA的正義鏈序列為5’-GGCAGTCTTCAGCCTATTA-3’，

反義鏈序列為5’-TAATAGGCTGAAGACTGCC-3’。

所述步驟三中一次孵育是先將融合成雙鏈的混合體系置于94℃孵育4分鐘，之后置于恒溫70℃的水浴中孵育10分鐘，之后關閉對水浴的加熱使水浴逐漸緩慢降溫至室溫。

所述步驟三中二次孵育是先在37℃孵育60分鐘，之后在65℃孵育10分鐘。