[發明專利]一種用于制備水凝膠的膠原蛋白及其制備方法

有效

• 申請號: 202011491036.6
• 申請日: 2020-12-17
• 公開（公告）號: CN112521491B
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發明（設計）人: 王玠;許菲;曹俊
• 申請（專利權）人: 江南大學;江蘇省血吸蟲病防治研究所
• 主分類號: C07K14/78
• 分類號: C07K14/78;C12N15/70;C12N5/00;A61K47/42;A61L27/24;A61L27/52
• 代理公司: 北京睿博行遠知識產權代理有限公司 11297
• 代理人: 張燕平

本發明涉及一種用于制備水凝膠的膠原蛋白及其制備方法，設計了含有生物活性結構GFPGER區域的膠原蛋白序列，并在膠原蛋白序列的若干位點引入具有氧化交聯特性的半胱氨酸，通過大腸桿菌異源表達獲得四種純度較高的含半胱氨酸膠原蛋白。采用雙氧水為交聯劑對膠原蛋白進行交聯制備得到水凝膠。本發明制備得到的膠原蛋白具有較好的溫敏性，在氧化環境中能夠形成穩定的水凝膠構筑，并對細胞無毒性，為藥物控釋載體的應用提供了較好的基礎。

技術領域

本發明涉及一種用于制備水凝膠的膠原蛋白及其制備方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

膠原蛋白是一類重要的生物高分子材料，為動物結締組織的主要成分，是哺乳動物體內含量最多、分布最廣的功能性蛋白，占蛋白質總量的30％左右。膠原蛋白具有良好的生物相容性、低免疫原性和組織可降解吸收性，在創面止血、愈合，缺損組織的填充、修復及重建，對生物體進行診斷、治療、修復以及藥物載體和組織工程等方面有廣泛應用，是理想的醫用生物材料。

天然膠原蛋白來源廣泛，主要存在與動物的肌腱、骨、皮膚、韌帶等組織中，是膠原蛋白原料的主要來源。提取膠原蛋白的方法有酸法、堿法、鹽法、酶法。然而，在提取中存在蛋白變性、結構破壞、蛋白得率低等問題，并可能產生致病和免疫不良反應及批次間的差異性問題。人工重組合成膠原蛋白成為一種新的途徑。重組類人膠原蛋白是采用生物基因工程技術將膠原蛋白的基因片段，借助工具酶拼接到適合的載體然后轉移到宿主細胞中誘導表達得到，具有質量可控、加工性強、水溶性好、周期性短、較低排斥反應等優點，常見的宿主表達系統有大腸桿菌、酵母菌等。然而，與人工化學合成的高分子蛋白相比，膠原蛋白在力學特性方面仍然存在缺陷，其無法進行自組裝或被加工成納米顆粒、水凝膠等多種材料形式，在藥物控釋、藥物傳輸及組織工程等領域的應用前景還有待進一步挖掘。存在成膠所需蛋白濃度高、成膠時間等缺點，限制了其在藥物傳輸及組織工程的應用。

水凝膠材料由于其質地柔軟，可模擬天然細胞外基質，具備應用于體內生理環境的天然特性等，正受到廣泛關注。目前已報道的有人工合成類絲彈性蛋白水凝膠，其主要基于絲蛋白肽段單元間的物理交聯形成凝膠網絡，可快速溫和氧化成膠，并賦予該水凝膠以氧化還原響應性及可調的力學性能，使其潛在應用于可控的藥物傳輸及組織工程，但此類水凝膠與細胞之間的粘附作用差，不適合進行體內應用。

發明內容

本發明是為了解決上述提出的問題，提供了一種用于制備水凝膠的膠原蛋白及其制備方法。

本發明采用如下技術方案：

一種用于制備水凝膠的膠原蛋白S-VCL-S，其序列為SEQ ID No.1所示。

一種用于制備水凝膠的膠原蛋白S-VCL-S1，其序列為SEQ ID No.2所示。

一種用于制備水凝膠的膠原蛋白S-VCL-S2，其序列為SEQ ID No.3所示。

一種用于制備水凝膠的膠原蛋白S-VCL-S3，其序列為SEQ ID No.4所示。

所述膠原蛋白的制備方法，將帶有膠原蛋白基因的pET-28a質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，挑取單克隆進行搖瓶發酵生產，收集菌體，得到重組蛋白；將重組蛋白分離純化后最終得到目標膠原蛋白。

進一步地，具體步驟如下：

(1)設計膠原蛋白序列，將該基因片段連接至pET-28a質粒上，并設計雙酶切位點，以驗證攜帶的基因片段；

(2)采用已經驗證片段的pET-28a質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)；挑取單克隆進行蛋白表達測試，驗證其轉化結果；

(3)挑取單克隆依次進行搖瓶發酵生產、分離純化，最后得到目標膠原蛋白。

進一步地，所述步驟(1)中在基因兩端設計了限制性內切酶Nco I和Bam HI位點，通過酶切驗證其基因長度。