[發明專利]利用梨再生體系從嵌合多倍體中分離純化多倍體的方法

在審

• 申請號: 202011491016.9
• 申請日: 2020-12-17
• 公開（公告）號: CN112616662A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 徐凌飛;向方昕;王志剛;翟銳
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 西安匠成知識產權代理事務所(普通合伙) 61255
• 代理人: 商宇科

本發明涉及一種利用梨再生體系從嵌合多倍體中分離純化多倍體的方法，本發明包括以下步驟：1)外植體的建立；1.1)外植體的獲得：以梨花器官作為外植體來源；1.2)外植體的消毒；1.3)外植體的預培養：將梨子房接種在PIM培養基上預培養；2)體細胞胚誘導成苗：將預培養的子房在無菌條件下轉移至IM培養基上培養，誘導體細胞胚分化成苗；3)幼苗的倍性鑒定：選擇健康葉片，利用解離液解離細胞后，用細胞流式儀鑒定倍性；4)幼苗的擴繁。本發明可以簡單、短時、高效的從梨嵌合多倍體中分離、純化出多倍體植株。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其是一種利用梨再生體系從嵌合多倍體中分離純化多倍體的方法。

背景技術

多倍體育種是園藝植物種質創新的重要手段之一。對于梨品種而言，多倍體品種的果實普遍比二倍體大、且果實品質優良、抗逆性強。果樹的自發芽變是現有多倍體品種的重要來源，但芽變育種仍存在很多缺點。如自發芽變時突變細胞與野生細胞的伴生發育，容易形成嵌合體且嵌合類型難以控制，因此導致突變性狀不穩定和突變性狀容易丟失。這種不穩定性不僅制約了芽變選種的發展，其導致的優秀突變性狀和特殊種質資源流失也是育種工作的一大損失。

發明內容

本發明為解決背景技術中存在的技術問題，而提供一種利用梨再生體系從嵌合多倍體中分離純化多倍體的方法，可以簡單、短時、高效的從梨嵌合多倍體中分離、純化出多倍體植株。

本發明的技術解決方案是：本發明為一種利用梨再生體系從嵌合多倍體中分離純化多倍體的方法，其特殊之處在于：該方法包括以下步驟：

1)外植體的建立；

1.1)外植體的獲得：以梨花器官作為外植體來源；

1.2)外植體的消毒；

1.3)外植體的預培養：將梨子房接種在PIM培養基上預培養；

2)體細胞胚誘導成苗：將預培養的子房在無菌條件下轉移至IM培養基上培養，誘導體細胞胚分化成苗；

3)幼苗的倍性鑒定：選擇健康葉片，利用解離液解離細胞后，用細胞流式儀鑒定倍性；

4)幼苗的擴繁。

優選的，步驟1.1)中選擇嵌合多倍體梨9712為材料；選擇梨盛花期前7天(具體日期視當年物候條件而定以未開花的花蕾和子房為建立外植體的材料。

優選的，步驟1.2)的具體步驟如下：將采摘的梨子房在25℃，清水沖洗6小時；用70％酒精搖晃消毒30秒；無菌水涮洗30秒，重復4次；用15％次氯酸鈉消毒20分鐘，期間搖晃4次；最后用無菌水涮洗30秒，重復4次。

優選的，步驟1.3)中PIM培養基的具體配方為：基本元素：1/2QL培養基(現有的商業化培養基)的大量和微量元素，補充24mg/LEDTA螯合鐵、250mg/L硝酸鉀，97mg/L七水合硫酸鎂，407mg/L硝酸銨；激素：0.2mg/LIBA；碳源：30g/L蔗糖。

優選的，步驟1.3)中預培養條件具體為：25攝氏度，暗培養4天。

優選的，步驟1.3)中接種方式具體為：在無菌的超凈臺中將無菌的花蕾連同下部的子房沿徑向一切為二，露出花藥和胚珠，切去多余花梗后，切割面朝下貼在培養基上。

優選的，步驟2)中IM培養基的具體配方為：基本元素：1/2QL培養基(現有的商業化培養基)的大量和微量元素，補充24mg/LEDTA螯合鐵、250mg/L硝酸鉀，97mg/L七水合硫酸鎂，407mg/L硝酸銨，2.2mg/LTDZ；激素：0.2mg/LIBA；碳源：30g/L蔗糖。

優選的，步驟2)中誘導體細胞胚分化成苗的培養條件具體為：25攝氏度，暗培養60天，培養30天后更換新的IM培養基。