[發明專利]利用梨再生體系從嵌合多倍體中分離純化多倍體的方法

在審

• 申請號: 202011491016.9
• 申請日: 2020-12-17
• 公開（公告）號: CN112616662A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 徐凌飛;向方昕;王志剛;翟銳
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 西安匠成知識產權代理事務所(普通合伙) 61255
• 代理人: 商宇科

1.一種利用梨再生體系從嵌合多倍體中分離純化多倍體的方法，其特征在于：該方法包括以下步驟：

1)外植體的建立；

1.1)外植體的獲得：以梨花器官作為外植體來源；

1.2)外植體的消毒；

1.3)外植體的預培養：將梨子房接種在PIM培養基上預培養；

2)體細胞胚誘導成苗：將預培養的子房在無菌條件下轉移至IM培養基上培養，誘導體細胞胚分化成苗；

3)幼苗的倍性鑒定：選擇健康葉片，利用解離液解離細胞后，用細胞流式儀鑒定倍性；

4)幼苗的擴繁。

2.根據權利要求1所述的利用梨再生體系從嵌合多倍體中分離純化多倍體的方法，其特征在于：所述步驟1.1)中選擇嵌合多倍體梨9712為材料；選擇梨盛花期前7天以未開花的花蕾和子房為建立外植體的材料。

3.根據權利要求2所述的利用梨再生體系從嵌合多倍體中分離純化多倍體的方法，其特征在于：所述步驟1.2)的具體步驟如下：將采摘的梨子房在25℃，清水沖洗6小時；用70％酒精搖晃消毒30秒；無菌水涮洗30秒，重復4次；用15％次氯酸鈉消毒20分鐘，期間搖晃4次；最后用無菌水涮洗30秒，重復4次。

4.根據權利要求3所述的利用梨再生體系從嵌合多倍體中分離純化多倍體的方法，其特征在于：所述步驟1.3)中PIM培養基的具體配方為：基本元素：1/2QL培養基的大量和微量元素，補充24mg/L EDTA螯合鐵、250mg/L硝酸鉀，97mg/L七水合硫酸鎂，407mg/L硝酸銨；激素：0.2mg/L IBA；碳源：30g/L蔗糖。

5.根據權利要求4所述的利用梨再生體系從嵌合多倍體中分離純化多倍體的方法，其特征在于：所述步驟1.3)中預培養條件具體為：25攝氏度，暗培養4天。

6.根據權利要求5所述的利用梨再生體系從嵌合多倍體中分離純化多倍體的方法，其特征在于：所述步驟1.3)中接種方式具體為：在無菌的超凈臺中將無菌的花蕾連同下部的子房沿徑向一切為二，露出花藥和胚珠，切去多余花梗后，切割面朝下貼在培養基上。

7.根據權利要求6所述的利用梨再生體系從嵌合多倍體中分離純化多倍體的方法，其特征在于：所述步驟2)中IM培養基的具體配方為：基本元素：1/2QL培養基的大量和微量元素，補充24mg/L EDTA螯合鐵、250mg/L硝酸鉀，97mg/L七水合硫酸鎂，407mg/L硝酸銨，2.2mg/L TDZ；激素：0.2mg/L IBA；碳源：30g/L蔗糖。

8.根據權利要求7所述的利用梨再生體系從嵌合多倍體中分離純化多倍體的方法，其特征在于：所述步驟2)中誘導體細胞胚分化成苗的培養條件具體為：25攝氏度，暗培養60天，培養30天后更換新的IM培養基。

9.根據權利要求8所述的利用梨再生體系從嵌合多倍體中分離純化多倍體的方法，其特征在于：所述步驟4)的具體步驟如下：在幼苗培養4周后，選擇生長勢健壯的組培苗，切除植株下部愈傷組織和多余的葉片，保留植株上半部約2～3cm，移入MS培養基中繼代和培養，培養溫度為25±2℃，光照培養，光源為日光燈，光照強度2000lx，光周期16h。