[發明專利]一種通過GUS染色顯示擬南芥植株不同部位轉錄因子ABI5活力的方法

在審

• 申請號: 202011489322.9
• 申請日: 2020-12-16
• 公開（公告）號: CN112553247A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 宛雯;楊緒勤;蔣繼宏
• 申請（專利權）人: 江蘇師范大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/56;C12N15/29;A01H5/10;A01H5/00;A01H6/20
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 馬進

1.一種利用GUS染色方法顯示擬南芥不同部位轉錄因子ABI5活力的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：構建受擬南芥轉錄因子ABI5蛋白調控的GUS表達載體p5XABS-GUS；

S2：將p5XABS-GUS通過化學轉化方法轉化進入農桿菌中；

S3：采用農桿菌介導的花粉管導入法，將p5XABS-GUS轉化進入擬南芥植株中，收集侵染后的擬南芥種子；

S4：培養步驟S3獲得的種子并進行篩選和鑒定，獲得擬南芥轉化株系并收集種子；

S5：培養步驟S4中的種子，通過GUS染色顯示擬南芥幼苗不同部位ABI5調控強弱。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S1包括：

S1-1：將擬南芥轉錄因子ABI5蛋白特異性結合的DNA序列堿基串聯重復5次，獲得5XABS序列；

S1-2：將5XABS序列與最小CaMV 35S啟動子序列相連組成5XABS啟動子序列；

S1-3：合成5XABS啟動子序列，并克隆到載體pCAMBIA1301載體的EcoRI/NcoI位點，獲得表達載體p5XABS-GUS。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S4包括：

S4-1：培養步驟S3獲得的種子，通過潮霉素篩選方法篩選轉化植株并收集種子；

S4-2：培養步驟S4-1獲得的種子，通過GUS染色鑒定轉化植株進行復篩，獲得擬南芥轉化株系并收集種子。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟S4-1包括：

1)將步驟S3獲得的種子消毒：分別采用70％酒精消毒2min，無菌水沖洗3次，20％的次氯酸鈉消毒15min，無菌水沖洗5-6次；

2)將處理后的種子用l ml無菌水重懸并均勻涂布在含有潮霉素B的MS固體篩選培養基上；

3)將MS固體篩選培養基置于光照培養箱中，25℃，16h光照/8h黑夜光周期培養；兩周后，得長勢正常的陽性植物；

4)將長勢正常的轉化株，移入另一個不含潮霉素的MS固體培養平板上，25℃，16h光照/8h黑夜光周期培養；4天后，移入營養土中，25℃，16h光照/8h黑夜光周期于溫室培養，收集種子。

5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟S4-2包括：

1)將步驟S4-1獲得的種子消毒：分別采用70％酒精消毒2min，無菌水沖洗3次，20％的次氯酸鈉消毒15min，無菌水沖洗5-6次；

2)將處理后的種子用lml無菌水重懸并均勻涂布在MS固體培養基表面；

3)將MS固體培養基置于光照培養箱中，25℃，16h光照/8h黑夜光周期培養；一周后，將小苗分別移栽入營養土中，25℃，16h光照/8h黑夜光周期于溫室培養，2周后，用無菌剪刀分別剪下每個苗的一片蓮座葉；使用GUS染色液染色；挑選染色相對較深的葉片所對應株系，培養并收集種子，得構建好的擬南芥轉化株系5XABS::GUS/Col。

6.權利要求1或2所述方法中制備的表達載體p5XABS-GUS。