[發明專利]一種通過GUS染色顯示擬南芥植株不同部位轉錄因子ABI5活力的方法

在審

• 申請號: 202011489322.9
• 申請日: 2020-12-16
• 公開（公告）號: CN112553247A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 宛雯;楊緒勤;蔣繼宏
• 申請（專利權）人: 江蘇師范大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/56;C12N15/29;A01H5/10;A01H5/00;A01H6/20
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 馬進

利用GUS染色顯示擬南芥植株不同部位轉錄因子ABI5活力的方法，主要包括:受ABI調控的GUS表達載體的構建；GUS表達載體轉化進入農桿菌；農桿菌介導的花粉管法將GUS表達載體轉入擬南芥中；擬南芥轉化株系的篩選和鑒定。本發明的方法可以用于研究擬南芥中與ABI5蛋白相關代謝路徑的調控機制；且該構建方法具有廣泛的適用性，可以普遍用于其他植株中，利用GUS染色顯示不同部位轉錄因子的調控活力。

技術領域

本發明涉及擬南芥ABI5活力顯示株系的構建方法，具體涉及一種利用GUS染色方法顯示擬南芥不同部位轉錄因子ABI5活力的方法。

背景技術

ABI5(ABA-INSENSITIVE 5)是擬南芥響應干旱/高鹽脅迫下的一個重要的轉錄因子，屬于堿性亮氨酸拉鏈(basic domain leucine zipper，bZlP)類轉錄因子。這些轉錄因子可以與特定的順式作用元件相結合，從而組成特定的調控網絡。在植物遭受外界脅迫條件下，他們通過調控不同基因的表達，調節擬南芥植株自身的生長發育，從而對脅迫產生耐受性。因此，闡明轉錄因子ABI5如何調控植物的生長發育，及其分子機理具有重要的研究價值。有利于培育新的抗旱/抗鹽轉基因作物。而研究擬南芥不同時空，其ABI5調控活力的變化規律，是ABI5調控植物生長代謝機制的一個關鍵部分，對于闡明其調控機制的作用模式具有重要價值。

GUS(b-glucuronidase)基因是一種重要的報告基因，廣泛應用于植物學研究中。GUS基因來源于大腸桿菌，該基因編碼一種水解酶，b-葡聚糖苷酶，可以催化底物5-溴-4-氯-3吲哚葡聚糖醛酸苷(X-Gluc)分解，產生肉眼可見的蘭色化合物。因此GUS染色技術可以用于觀察轉基因植物的外源基因的表達情況。由于植物體內沒有類似的基因存在，故GUS染色技術具有操作簡單、背景低，且可以檢測到具體細胞、組織部位的表達強弱情況。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用GUS染色方法顯示擬南芥植株不同位置轉錄因子ABI5調控強弱的方法，通過將ABI5特異性結合的結合位點進行串聯重復，并與最小CaMV35S啟動子序列相結合，構建出受ABI5結合強弱調控的啟動子，再將該啟動子克隆到pCAMBIA1301載體的GUS基因上游，使GUS基因表達受ABI5調控活力的調控，并將該調控元件導入擬南芥野生型Col中，構建擬南芥轉基因植物。該植株可以通過GUS染色檢測在不同時間和空間條件下，擬南芥轉錄因子ABI5的調控活力的變化情況。有利于闡明轉錄因子ABI5的調控作用機理。

為實現上述目的，本發明的技術方案具體如下：

一種利用GUS染色方法顯示擬南芥不同部位轉錄因子ABI5活力的方法，包括以下步驟：

S1：構建受擬南芥轉錄因子ABI5蛋白調控的GUS表達載體p5XABS-GUS；

S2：將p5XABS-GUS通過化學轉化方法轉化進入農桿菌中；

S3：采用農桿菌介導的花粉管導入法，將p5XABS-GUS轉化進入擬南芥植株中，收集侵染后的擬南芥種子；

S4：培養步驟S3獲得的種子并進行篩選和鑒定，獲得擬南芥轉化株系并收集種子；

S5：培養步驟S4中的種子，通過GUS染色顯示擬南芥幼苗不同部位ABI5調控強弱。

進一步的，所述步驟S1包括：

S1-1：將擬南芥轉錄因子ABI5蛋白特異性結合的DNA序列堿基串聯重復5次，獲得5XABS序列；

S1-2：將5XABS序列與最小CaMV 35S啟動子序列相連組成5XABS啟動子序列；

S1-3：合成5XABS啟動子序列，并克隆到載體pCAMBIA1301載體的EcoRI/NcoI位點，獲得表達載體p5XABS-GUS。

進一步的，所述步驟S4包括：