[發(fā)明專(zhuān)利]一種新型細(xì)胞外基質(zhì)生物支架材料及其制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011487270.1
• 申請(qǐng)日: 2020-12-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112656991A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王之發(fā);馬軍利;汪維健;孫爍輝;韓冷;李瀟
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): A61L27/36
• 分類(lèi)號(hào): A61L27/36;A61L27/50;C12N5/0775
• 代理公司: 北京八月瓜知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11543
• 代理人: 李斌

本發(fā)明涉及生物材料技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種新型細(xì)胞外基質(zhì)生物支架材料及其制備方法。分離培養(yǎng)兔子的骨髓干細(xì)胞，在體外成膜誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得骨髓干細(xì)胞膜片；在磷酸緩沖鹽溶液中漂洗；用十二烷基硫酸鈉脫細(xì)胞液進(jìn)行多次脫細(xì)胞處理，漂洗；加入Triton?X100去除殘留的細(xì)胞碎片，再次漂洗；去除殘留的DNA和RNA，漂洗，獲得生物支架材料。采用本發(fā)明的脫細(xì)胞方式處理，使得骨髓干細(xì)胞膜片中的細(xì)胞被去除后，殘留的細(xì)胞空間結(jié)構(gòu)完好，存留的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)致密，排列規(guī)則，有大量膠原纖維存在；該生物支架材料來(lái)源于兔子的骨髓干細(xì)胞，消除了抗原性，具有良好的組織相容性和生物誘導(dǎo)能力，可以很好地修復(fù)兔子的骨軟骨復(fù)合體缺損。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物材料技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種新型細(xì)胞外基質(zhì)生物支架材料及其制備方法。

背景技術(shù)

在現(xiàn)代軍事力量條件下發(fā)生的戰(zhàn)爭(zhēng)和漸漸增多的車(chē)禍等嚴(yán)重事故會(huì)引起頜面部戰(zhàn)創(chuàng)傷，進(jìn)而導(dǎo)致頜面部軟硬組織的缺損，造成患者面部畸形和功能障礙，嚴(yán)重影響患者的心理健康和生存質(zhì)量。目前，關(guān)于支架材料的研究受到廣泛關(guān)注，成功獲得理想性能的支架材料對(duì)軟硬組織的修復(fù)具有重要意義。

理想的組織工程支架材料是要能被宿主骨組織逐步吸收替代，最終與自體骨形成牢固的骨性愈合。單純的無(wú)機(jī)材料替代物具有易碎、力學(xué)性能不匹配、體內(nèi)降解緩慢及愈合延遲等缺點(diǎn)。單純的有機(jī)物支架材料，其結(jié)構(gòu)和功能與人體骨組織差距很大存在力學(xué)強(qiáng)度差、降解產(chǎn)物堆積引起酸性環(huán)境不易于組織愈合等缺點(diǎn)。無(wú)機(jī)材料與有機(jī)材料的復(fù)合，雖然其結(jié)構(gòu)和組成接近骨組織，但要真正在體外預(yù)構(gòu)天然骨組織的納米結(jié)構(gòu),受到目前材料制作工藝水平的限制難以達(dá)到臨床需要的水平。生物可降解材料在支架方面的使用是具有劃時(shí)代意義的。生物衍生骨支架材料是利用異種或異體骨,經(jīng)過(guò)機(jī)械加工塑形后，用理化法、酶解法等處理掉抗原和細(xì)胞,保留其基本結(jié)構(gòu)及部分生物活性的一類(lèi)材料,具有很好的應(yīng)用前景。

現(xiàn)有的組織工程支架材料還不能滿(mǎn)足臨床要求，尋找和開(kāi)發(fā)新型骨支架材料迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一目的在于提供一種新型細(xì)胞外基質(zhì)生物支架材料。該生物支架材料結(jié)構(gòu)致密，排列規(guī)則，有大量膠原纖維存在，具有良好的組織相容性和生物誘導(dǎo)能力，可以很好地修復(fù)兔子的骨軟骨復(fù)合體缺損。本發(fā)明的第二目的在于提供一種新型細(xì)胞外基質(zhì)生物支架材料的制備方法，該方法操作簡(jiǎn)單，應(yīng)用方便。

本發(fā)明提供的一種新型細(xì)胞外基質(zhì)生物支架材料，制備方法包括以下步驟：

(1)分離培養(yǎng)兔子的骨髓干細(xì)胞，在體外成膜誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得骨髓干細(xì)胞膜片；

(2)將獲得的骨髓干細(xì)胞膜片在磷酸緩沖鹽溶液中漂洗；

(3)用十二烷基硫酸鈉脫細(xì)胞液進(jìn)行多次脫細(xì)胞處理，然后用磷酸緩沖鹽溶液漂洗；

(4)隨后加入Triton-X100去除殘留的細(xì)胞碎片，再次用磷酸緩沖鹽溶液漂洗；

(5)再去除殘留的DNA和RNA，最后再用磷酸緩沖鹽溶液漂洗，獲得生物支架材料。

優(yōu)選地，步驟(1)中分離培養(yǎng)兔子的骨髓干細(xì)胞包括以下步驟：

a.用速眠新Ⅱ號(hào)與氯胺酮混合后對(duì)兔子進(jìn)行肌肉注射將兔子麻醉，俯臥位放置，進(jìn)行備皮和消毒，雙側(cè)髂嵴表面用鹽酸利多卡因局部浸潤(rùn)麻醉；

b.逐層切開(kāi)雙側(cè)髂嵴皮膚皮下組織，切取雙側(cè)髂骨、四肢股骨和脛骨，去除表面骨膜及軟骨，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用含有肝素、胎牛血清、青霉素和L-谷胺酰胺的DMEM-F12培養(yǎng)基沖洗髓腔，獲得骨髓液；

c.將步驟b中獲得的骨髓液進(jìn)行過(guò)濾，將過(guò)濾后的骨髓液接種到培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％CO₂的孵箱內(nèi)培養(yǎng)；