[發明專利]一種新型細胞外基質生物支架材料及其制備方法

在審

• 申請號: 202011487270.1
• 申請日: 2020-12-16
• 公開（公告）號: CN112656991A
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發明（設計）人: 王之發;馬軍利;汪維健;孫爍輝;韓冷;李瀟
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍南部戰區總醫院
• 主分類號: A61L27/36
• 分類號: A61L27/36;A61L27/50;C12N5/0775
• 代理公司: 北京八月瓜知識產權代理有限公司 11543
• 代理人: 李斌

1.一種新型細胞外基質生物支架材料，其特征在于，制備方法包括以下步驟：

(1)分離培養兔子的骨髓干細胞，在體外成膜誘導培養，獲得骨髓干細胞膜片；

(2)將獲得的骨髓干細胞膜片在磷酸緩沖鹽溶液中漂洗；

(3)用十二烷基硫酸鈉脫細胞液進行多次脫細胞處理，然后用磷酸緩沖鹽溶液漂洗；

(4)隨后加入Triton-X100去除殘留的細胞碎片，再次用磷酸緩沖鹽溶液漂洗；

(5)再去除殘留的DNA和RNA，最后再用磷酸緩沖鹽溶液漂洗，獲得生物支架材料。

2.根據權利要求1所述的一種新型細胞外基質生物支架材料，其特征在于，步驟(1)中分離培養兔子的骨髓干細胞包括以下步驟：

a.用速眠新Ⅱ號與氯胺酮混合后對兔子進行肌肉注射將兔子麻醉，俯臥位放置，進行備皮和消毒，雙側髂嵴表面用鹽酸利多卡因局部浸潤麻醉；

b.逐層切開雙側髂嵴皮膚皮下組織，切取雙側髂骨、四肢股骨和脛骨，去除表面骨膜及軟骨，在超凈工作臺內用含有肝素、胎牛血清、青霉素和L-谷胺酰胺的DMEM-F12培養基沖洗髓腔，獲得骨髓液；

c.將步驟b中獲得的骨髓液進行過濾，將過濾后的骨髓液接種到培養皿中，置于37℃、5％CO₂的孵箱內培養；

d.接種后第47.5-48.5小時進行一次半換液，再過71.5-72.5小時后進行一次全換液，此后每隔兩天進行一次全換液，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，選用第一代骨髓干細胞誘導成膜片。

3.根據權利要求2所述的一種新型細胞外基質生物支架材料，其特征在于，所述兔子為健康4周齡雄性新西蘭白兔。

4.根據權利要求1所述的一種新型細胞外基質生物支架材料，其特征在于：步驟(1)中體外成膜誘導的培養基采用含58-62μg/ml抗壞血酸和20-22％胎牛血清的高糖培養基，誘導培養時間為2-4周。

5.根據權利要求1所述的一種新型細胞外基質生物支架材料，其特征在于，步驟(3)為：加入0.5％-1.5％的十二烷基硫酸鈉脫細胞液進行脫細胞，并在30-60分鐘后進行第一次更換新的十二烷基硫酸鈉脫細胞液，再過1-2小時進行第二次更換新的十二烷基硫酸鈉脫細胞液，再過4-6小時進行第三次更換新的十二烷基硫酸鈉脫細胞液，第三次換液后脫細胞處理24-36小時，然后用磷酸緩沖鹽溶液漂洗。

6.根據權利要求1所述的一種新型細胞外基質生物支架材料，其特征在于：步驟(4)中加入Triton-X100浸泡作用29-31分鐘去除殘留的細胞碎片，Triton-X100的濃度為0.5％-1％。

7.根據權利要求1所述的一種新型細胞外基質生物支架材料，其特征在于：步驟(2)中漂洗次數為三次，步驟(3)中漂洗次數為三次，步驟(4)中漂洗次數為三次，漂洗時間均為4.5-5.5分鐘，漂洗采用恒溫振蕩器進行，轉速為145-155rpm。

8.根據權利要求1所述的一種新型細胞外基質生物支架材料，其特征在于，步驟(5)為：加入含有DNA酶和RNA酶的DMEM浸泡作用23.5-24.5小時去除殘留的DNA和RNA，所述DMEM中DNA酶和RNA酶的含量均為1％，最后再用磷酸緩沖鹽溶液漂洗，獲得生物支架材料。

9.根據權利要求8所述的一種新型細胞外基質生物支架材料，其特征在于，步驟(5)中再用磷酸緩沖鹽溶液漂洗為：再用磷酸緩沖鹽溶液漂洗三次，每次2.5-3.5分鐘，然后再用磷酸緩沖鹽溶液漂洗24-36小時。

10.一種權利要求1-9任一所述的一種新型細胞外基質生物支架材料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)分離培養兔子的骨髓干細胞，在體外成膜誘導培養，獲得骨髓干細胞膜片；

(2)將獲得的骨髓干細胞膜片在磷酸緩沖鹽溶液中漂洗；

(3)用十二烷基硫酸鈉脫細胞液進行多次脫細胞處理，然后用磷酸緩沖鹽溶液漂洗；

(4)隨后加入Triton-X100去除殘留的細胞碎片，再次用磷酸緩沖鹽溶液漂洗；

(5)再去除殘留的DNA和RNA，最后再用磷酸緩沖鹽溶液漂洗，獲得生物支架材料。