[發明專利]一種新型mariner轉座子系統、應用和構建枯草芽孢桿菌插入突變株文庫

在審

• 申請號: 202011484796.4
• 申請日: 2020-12-16
• 公開（公告）號: CN112553237A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 楊洪江;李東航;張志強;龐文靜;秦旭穎
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N15/65;C12N15/54;C12N1/21;C12R1/125
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

本發明涉及一種新型mariner轉座子系統，所述系統包含如下元件：⑴已測序的mariner轉座子，該轉座子GenBank序列接收號為KJ933396；⑵額外添加在步驟⑴中已測序的mariner轉座子的ITR區域中的壯觀霉素抗性基因spc；⑶能在大腸桿菌細胞內復制的宿主復制起始區；⑷能在枯草芽孢桿菌細胞內復制的溫度敏感性質粒復制起始區；⑸溫度敏感性質粒的載體耐藥性基因ermC。本新型系統插入位點隨機性強，序列清晰，插入位置可快速鑒定，且受受體菌內源性轉座子的影響較小，與現有的轉座子相比，實用性更強，具有插入位點隨機性強，能夠利用反向PCR方法鑒定轉座子在基因組的插入位置的優點。

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，尤其是一種新型mariner轉座子系統、應用和構建枯草芽孢桿菌插入突變株文庫。

背景技術

轉座因子或轉座子是一類在很多動物中(包括線蟲、昆蟲和人等)存在的可自由移動的跳躍因子，可以自主復制并跳躍插入到某功能基因中，引起該基因失活，產生突變體。轉座子參與很多遺傳現象，例如基因重排、質粒與染色體整合等。現在轉座子突變技術已經成為微生物分子遺傳學研究的重要工具之一，特別是具有隨機轉座特性的轉座子已經成為發現新基因、克隆功能基因、發掘已知基因的新功能以及研究蛋白功能的有效工具。

枯草芽孢桿菌是益生菌和微生物發酵的主要工業菌株，構建轉座子突變株文庫對于枯草芽孢桿菌基因組的功能注釋具有重要意義。目前國際上通用的枯草芽孢桿菌的轉座子為Tn917和Tn551，Tn55來自金黃色葡萄球菌，Tn917來自糞鏈球菌，這兩個轉座子均含有紅霉素抗性基因，具有同源性，它們的末端反向重復序列與革蘭氏陰性的Tn-3家族的末端反向重復序列之間有很高的同源性，但是有研究表明，以這兩種轉座子構建的轉座子突變株文庫隨機性較差，具有轉座子插入“熱點”，不能得到完全覆蓋全基因組的轉座子突變株文庫；含有mariner轉座酶的用于革蘭氏陽性菌的轉座子系統pBTn，以溫度敏感性質粒pBT2作為載體，整合了兩端帶有重復序列的紅霉素耐藥基因，在紅霉素的耐藥基因和來源于mariner真核轉座子的轉座酶間插入來源于pTX15的啟動子，以轉座子pBTn構建的突變文庫無明顯插入熱點，具有高度隨機性和單一性，轉座子pBTn的插入位置確定較難，轉座效率不確定。

Tc1/Mariner轉座子是自然界中分布最廣泛的一類DNA轉座子超家族，家族成員的全長一般為1300～2400bp，其中包含一個單基因編碼的轉座酶，側翼為反向末端重復序列(inverted terminal repeats,ITRs)。當轉座酶與ITRs結合時，可以促進轉座的發生。在自然界已經發現14個有活性的Tc1/Mariner類型轉座子，如Minos和Mos1等。另外通過分子重構也獲得高活性的人工轉座子，如Sleeping Beauty,SB。SB和Mos1等轉座子作為基因轉移載體已被廣泛應用于轉基因、基因捕獲和基因治療等領域的研究中，并取得了很好的應用效果。

通過對比，本發明專利申請與上述專利公開文獻存在本質的不同。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種新型mariner轉座子系統、應用和構建枯草芽孢桿菌插入突變株文庫。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種新型mariner轉座子系統，用于構建枯草芽孢桿菌插入突變株文庫，所述系統包含如下元件：

⑴已測序的mariner轉座子，該轉座子GenBank序列接收號為KJ933396；

⑵額外添加在步驟⑴中已測序的mariner轉座子的ITR區域中的壯觀霉素抗性基因spc；

⑶能在大腸桿菌細胞內復制的宿主復制起始區；

⑷能在枯草芽孢桿菌細胞內復制的溫度敏感性質粒復制起始區；

⑸溫度敏感性質粒的載體耐藥性基因ermC。