[發明專利]RPA聯合CRISPR技術檢測炭疽桿菌的方法及成套試劑

有效

• 申請號: 202011484671.1
• 申請日: 2020-12-16
• 公開（公告）號: CN112522429B
• 公開（公告）日: 2021-07-16
• 發明（設計）人: 袁媛;王景林;孫巖松;王菁;辛文文;康琳;李巖偉
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/07
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 張立娜

本發明公開了RPA聯合CRISPR技術檢測炭疽桿菌的方法及成套試劑。本發明提供了用于檢測炭疽桿菌和/或篩查炭疽芽孢桿菌毒力株的成套引物組，含有特異于炭疽芽孢桿菌毒力株染色體基因BA_5345、質粒毒力基因pagA和capA的三套引物，每套引物均由RPA引物和crRNA組成，所述RPA引物根據靶基因保守序列設計，所述crRNA包括能夠與cas蛋白結合的錨定序列和與RPA引物擴增產物序列相匹配的間隔序列。本發明成套引物組對臨床模擬樣本、土壤模擬樣本樣本檢測均有較好的靈敏度和特異性，能有效區分炭疽桿菌毒力株和其他細菌，為炭疽桿菌體外診斷提供了快速檢測方法，同時對于炭疽桿菌在中國疫區的土壤環境篩查具重要意義。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及RPA聯合CRISPR技術檢測炭疽桿菌的方法及成套試劑。

背景技術

炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)是人類歷史上第一個被發現的病原菌，也是引起炭疽自然疫源性、人獸共患烈性傳染病的一種重要的人畜共患病病原體。我國西部農牧業地區云南、貴州、新疆等地為人間炭疽高發區。此外，由于炭疽芽孢在自然環境中的抵抗力極強，易生產，在軍事上一直被列為頭號生物戰劑。炭疽芽孢桿菌除了染色體基因組外，還含有兩個與其毒力密切相關的毒力質粒pXO1和pXO2。聯合檢測染色體上的特異基因及毒力質粒上的毒力基因，可用于炭疽芽孢桿菌毒力株的快速篩查。當疫情來臨時，實驗室人員能否快速和準確的從樣品中檢測出炭疽芽孢桿菌是防治疫情、診療患者工作的關鍵。

重組酶聚合酶擴增技術(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)是近年興起的一種恒溫擴增技術，由于RPA擴增方式無需復雜的溫度改變，適合用于現場快速檢測。但是，從原理上，其單級擴增反應的本質并未改變，相較于目前多數的實時定量PCR(q-PCR)檢測方式，并不能有實質性的靈敏度提升。

在CRISPR系統中，與常用于體外診斷識別RNA的Cas13a而言，Cas12a-crRNA能夠識別單鏈或雙鏈DNA，不需要將RPA擴增產物轉換成RNA而省去了轉錄步驟，且RPA產物DNA用于CRISPR的檢測相對于RNA而言也更加穩定且易于操作。RPA反應與CRISPR-Cas12a反應均可在37-42℃的恒溫下就能完成，這種兼顧RPA和CRISPR-Cas12a的同一等溫反應條件有利于快速便攜式現場檢測裝置的研發。

發明內容

為了有效的解決上述問題，本發明提供了一種用于炭疽芽孢桿菌毒力株的CRISPR檢測引物和crRNA，將此引物組及crRNA用于基于CRISPR-Cas12a技術的基因檢測中可快速現場檢測炭疽芽孢桿菌，具有特異性好，靈敏度高，簡易的優點。

第一方面，本發明提供了一種用于檢測炭疽桿菌和/或篩查炭疽芽孢桿菌毒力株的成套引物組。

本發明所提供的用于檢測炭疽桿菌和/或篩查炭疽芽孢桿菌毒力株的成套引物組，由如下組成：

(A1)引物組1：由RPA引物對1和crRNA1組成(針對的是炭疽芽孢桿菌染色體基因BA_5345)；

所述RPA引物對1是根據SEQ ID No.1所示核苷酸序列設計的；

所述crRNA1包括重復序列1和間隔序列1，所述重復序列1能夠與cas蛋白結合，所述間隔序列1與所述RPA引物對1的擴增產物序列相匹配。

(A2)引物組2：由RPA引物對2和crRNA2組成(針對的是質粒pXO1上的毒力基因pagA)；

所述RPA引物對2是根據SEQ ID No.2所示核苷酸序列設計的；

所述crRNA2包括重復序列2和間隔序列2，所述重復序列2能夠與cas蛋白結合，所述間隔序列2與所述RPA引物對2的擴增產物序列相匹配。

(A3)引物組3：由RPA引物對3和crRNA3組成(針對的是質粒pXO2上的毒力基因capA)；