[發明專利]RPA聯合CRISPR技術檢測炭疽桿菌的方法及成套試劑

有效

• 申請號: 202011484671.1
• 申請日: 2020-12-16
• 公開（公告）號: CN112522429B
• 公開（公告）日: 2021-07-16
• 發明（設計）人: 袁媛;王景林;孫巖松;王菁;辛文文;康琳;李巖偉
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/07
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 張立娜

1.用于檢測炭疽桿菌和/或篩查炭疽芽孢桿菌毒力株的成套引物組，由如下組成：

(A1)引物組1：由RPA引物對1和crRNA1組成；

所述RPA引物對1為由SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的兩條單鏈DNA組成的引物對；所述crRNA1的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示；

(A2)引物組2：由RPA引物對2和crRNA2組成；

所述RPA引物對2為由SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示的兩條單鏈DNA組成的引物對；所述crRNA2的核苷酸序列如SEQ ID No.27所示；

(A3)引物組3：由RPA引物對3和crRNA3組成；

所述RPA引物對3為由SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所示的兩條單鏈DNA組成的引物對；所述crRNA3的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示。

2.用于檢測炭疽桿菌和/或篩查炭疽芽孢桿菌毒力株的試劑盒，含有權利要求1所述的成套引物組。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還含有如下中的全部或部分：能結合單鏈核酸的重組酶、單鏈DNA結合酶、鏈置換型DNA聚合酶、dNTPs和醋酸鎂。

4.根據權利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還含有cas12a蛋白和/或信號報告探針和/或成套陽性參考質粒。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于：所述cas12a蛋白為LbCas12a蛋白。

6.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于：所述信號報告探針的序列如SEQ IDNo.34所示，5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團。

7.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于：所述成套陽性參考質粒由陽性參考質粒1、陽性參考質粒2和陽性參考質粒3組成；所述陽性參考質粒1為含有SEQ ID No.1的第8-517位所示DNA片段的質粒；所述陽性參考質粒2為含有SEQ ID No.2的第4-753位所示DNA片段的質粒；所述陽性參考質粒3為含有SEQ ID No.3的第5-872位所示DNA片段的質粒。

8.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于：所述熒光報告基團為FAM，所述熒光淬滅基團為BHQ1。

9.權利要求1所述的成套引物組或權利要求2-8中任一所述的試劑盒在如下任一中的應用：

(A1)制備用于檢測炭疽桿菌和/或篩查炭疽芽孢桿菌毒力株的產品；

(A2)制備用于診斷炭疽芽孢桿菌感染的產品；

(A3)制備用于診斷炭疽病的產品。

10.一種檢測炭疽桿菌和/或篩查炭疽芽孢桿菌毒力株的非疾病診斷性方法，包括如下步驟：

(b1)從待測樣本中提取DNA；

(b2)以(b1)提取的DNA為模板，采用權利要求1中所述的RPA引物對1、所述RPA引物對2和所述RPA引物對3分別進行RPA擴增，依次得到擴增產物1、擴增產物2和擴增產物3；

(b3)取(b2)所得擴增產物1，加入權利要求4或6或8中所述的信號報告探針、權利要求4或5中所述的cas12a蛋白和權利要求1中所述的crRNA1，形成反應體系1；取(b2)所得擴增產物2，加入權利要求4或6或8中所述的信號報告探針、權利要求4或5中所述的cas12a蛋白和權利要求1中所述的crRNA2，形成反應體系2；取(b2)所得擴增產物3，加入權利要求4或6或8中所述的信號報告探針、權利要求4或5中所述的cas12a蛋白和權利要求1中所述的crRNA3，形成反應體系3；將所述反應體系1、所述反應體系2和所述反應體系3分別進行CRISPR反應檢測，讀取檢測信號，根據檢測信號按照如下確定檢測結果：

若所述反應體系1的檢測信號為陽性，則所述待測樣本中含有或候選含有炭疽芽孢桿菌；若所述反應體系1的檢測信號為陰性，則所述待測樣本中不含有或候選不含有炭疽芽孢桿菌；

在所述反應體系1的檢測信號為陽性的情況下，若所述反應體系2和所述反應體系3的檢測信號也均為陽性，則所述待測樣本中含有或候選含有的炭疽芽孢桿菌為或候選為毒力株；若所述反應體系2和所述反應體系3的檢測信號均為陰性，則所述待測樣本中含有或候選含有的炭疽芽孢桿菌不為或候選不為毒力株。