[發明專利]一種紫菜赤腐病腐霉病原的鑒別檢測方法

有效

• 申請號: 202011483053.5
• 申請日: 2020-12-16
• 公開（公告）號: CN112646912B
• 公開（公告）日: 2022-11-15
• 發明（設計）人: 莫照蘭;茅云翔;何禮娟;李杰;李貴陽;楊慧超;唐磊
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 北京和信華成知識產權代理事務所(普通合伙) 11390
• 代理人: 胡劍輝

本發明公開了一種紫菜赤腐病腐霉病原的鑒別檢測方法，屬于藻類栽培病害檢測、鑒定及防治技術領域。該方法基于紫菜赤腐病病原P.porphyrae和P.chondricola基因組差異序列設計特異引物的設計，兩種腐霉病原單重PCR和雙重PCR檢測方法的建立。本方法能特異的鑒別檢出P.porphyrae和P.chondricola以及共同存在的可能。單重PCR引物P?for/P?rev檢測下限為10³拷貝數，C?for/C?rev引物檢測下限為10²拷貝數。雙重PCR檢測下限為10⁴拷貝數。本方法建立了一種特異、靈敏的紫菜赤腐病腐霉病原鑒別方法，能不經測序比對鑒別P.porphyrae和P.chondricola，為我國紫菜栽培中赤腐病的防控提供技術支撐。

技術領域

本發明屬于藻類栽培病害檢測、鑒定及防治技術領域，具體地說，涉及一種紫菜栽培中赤腐病致病菌——腐霉病原的鑒別及檢測方法。

背景技術

赤腐病是紫菜栽培期的主要病害，常發于水溫偏高、鹽度偏低、水流交換不暢、干出時間不足的海區。赤腐病發病病程迅速，爆發后一周之內可致使紫菜網簾變為空簾，導致減產30-50％，某些海區可達到60％以上。患病初期在葉片上能看到直徑2mm左右的紅色圓形病斑，2d之內病斑直徑可擴大到4-5mm，此時病斑呈邊緣紅色中間黃綠色，隨著病程發展病斑逐步擴大，距離較近的幾個病斑相互連接，一周內整個葉片全部壞死。顯微鏡下觀察可以看到細胞病變明顯，病斑處的紫菜細胞萎縮，被腐霉菌絲串聯起來，病斑邊界處細胞藻紅蛋白溶出。

目前已經確認多種病原均可引起紫菜赤腐病，包括紫菜腐霉P.porphyrae，P.chondricola以及鏈格孢霉Alternaria sp.等。腐霉是紫菜赤腐病的主要病原。Arasaki根據菌絲形態特征、生殖方式及生活史等確定該病原為卵菌綱(Oomycetes)腐霉屬(Pythium)中的一類。經過30多年的分類鑒定，直至20世紀70年代，Takahashi將該病原命名為紫菜腐霉(Pythium porphyrae)。后來發現腐霉屬另一種腐霉P.chondricola也可以引起紫菜的赤腐病。

紫菜赤腐病目前沒有治愈的方法，僅在病癥早期通過酸洗、冷藏和延長干出時間等措施能有效遏制病情蔓延。因此建立赤腐病的病原檢測方法是十分必要的，能為控制病情蔓延提供寶貴時間。Amano等利用單克隆抗體建立P.porphyrae菌絲和游動孢子的檢測方法，但該方法對病原檢出存在地域性差異。Addepalli等建立了一種多克隆抗體和間接熒光技術相結合的方法能檢測P.porphyrae的游動孢子及胞囊，但對其他腐霉有弱反應。Park等根據P.porphyrae的ITS序列設計特異引物PP-1和PP-2建立競爭PCR方法，能檢測菌絲、水體游動孢子，可應用于商品化的紫菜產品病原檢測及病原預警。2016年，渕上哲針對P.porphyrae的ITS序列建立熒光定量PCR檢測方法，能縮短檢測時間且具有較高的靈敏度，但實測樣品誤差較大。

在紫菜的兩種腐霉類病原中，P.porphyrae與P.chondricola在致病力上存在差異；但在菌絲形態、生殖方式、感染特征及轉錄間隔區(internal transcribed spacer,ITS)序列完全相同，無法通過以上特征進行區分，僅能夠通過細胞色素c氧化酶亞基1和2(cytochrome c oxidase subunit I and II,cox 1 and cox 2)基因序列中4個堿基的差異將其區別開。目前，紫菜赤腐病病原檢測方法均不能鑒別P.porphyrae和P.chondricola。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提出了一種利用P.porphyrae和P.chondricola基因組差異序列設計特異引物，建立P.porphyrae和P.chondricola的單重PCR和雙重PCR鑒別的檢測方法，并進行了特異性的檢測，為明確紫菜赤腐病病原提供技術支撐。

本發明的技術方案是：