[發明專利]一種基于固相法分離N-糖肽和O-糖肽的方法

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• 申請號: 202011481041.9
• 申請日: 2020-12-15
• 公開（公告）號: CN112578061A
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 楊霜;李舒偉
• 申請（專利權）人: 南京譜利健生物技術有限公司
• 主分類號: G01N30/08
• 分類號: G01N30/08;G01N30/88
• 代理公司: 上海浙晟知識產權代理事務所(普通合伙) 31345
• 代理人: 楊小雙

本發明公開了一種基于固相法分離N?糖肽和O?糖肽的方法，首先通過還原胺化反應將糖蛋白偶聯到固相樹脂上，然后對糖蛋白唾液酸進行衍生化并清洗，再加入蛋白消化酶對固定在樹脂上的糖蛋白進行降解處理。產生的糖肽用親水色譜柱富集。然后通過表面修飾凝集素的固相柱，將O?糖肽保留在凝集素固相柱上，而N?糖肽包含在過濾液中。采用O?糖肽切割酶(OpeRATOR)，將結合在凝集素上的O?糖肽切割洗脫；或采用多肽變性方法將O?糖肽洗脫。這樣就將N?糖肽和O?糖肽分別進行了富集分離，本方法對研究各種病毒的致病機制，包括新型冠狀病毒COVID?19，禽流感、寨卡病毒(Zika virus)和登革病毒(Denge virus)，開發疫苗等方面有著重要意義。

技術領域

本發明涉及生物分子分析試劑技術領域，具體涉及一種基于固相法分離N-糖肽和O-糖肽的方法。

背景技術：

蛋白質糖基化的分析通常包括多糖的組成和結構、糖基化位點和糖肽序列分析。基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜(MALDI-TOF)和液相色譜-電噴霧電離質譜(LC-ESI)是蛋白質糖基化研究的主要分析方法。蛋白質糖基化分為N-糖基化和O-糖基化兩種。N-糖基化發生在N-X-S/T(X＝除脯氨酸，絲氨酸和蘇氨酸以外的任何氨基酸)序列中的天冬酰胺(N)上。N-多糖可以用糖苷水解酶(例如PNGase A和PNGase F)從蛋白上切割下來進行進一步的研究。O-糖基化發生在沒有特定序列規則的絲氨酸和蘇氨酸上。

自然界尚未發現一種通用的糖苷水解酶可以將O-多糖從蛋白上切割下來。因此，O-多糖一般是用堿性化學方法處理，將之從蛋白上解離出來。在這種情況下，會產生過多的副反應，嚴重影響對O-多糖的組成和結構的分析。但是，最近發現了一些內切蛋白酶，可以識別O-多糖位點，并在O-多糖位點切割糖肽，有助于O-糖基化分析、O-多糖譜解析、O-聚糖位點測定等。例如，OpeRATOR(O-糖肽切割酶)是一種內切蛋白酶，該酶源自黏液阿克曼(Akkermansia muciniphila)，并在大腸桿菌中表達。該酶含有His標簽，分子量為42kDa。可催化天然黏蛋白型O-糖基化蛋白中與O-聚糖直接相鄰的肽鍵的水解。OpeRATOR高度特異性地在絲氨酸或蘇氨酸的O-多糖N端消化蛋白質，但是不會對帶有N-多糖的天冬酰胺消化。同時，在對該酶的活性位點進行變異后，能夠保留識別O-多糖位點的親和力，但是失去了對O-糖肽進行切割的能力。(Yang,S.；Onigman,P.；Wu,W.W.；Sjogren,J.；Nyhlen,H.；Shen,R.-F.；Cipollo,J.Anal.Chem.2018,90,8261-8269)。本發明利用了變異后的OpeRATOR的這種能力，實現了O-糖肽的特異性富集。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于固相法分離N-糖肽和O-糖肽的方法，以解決現有技術中將O-糖肽從蛋白上解離出來時會產生副反應的缺陷。

一種基于固相法分離N-糖肽和O-糖肽的方法，所述方法包括如下步驟：

將糖蛋白偶聯到固相樹脂上；

通過衍生化試劑對固相在樹脂上的糖蛋白唾液酸進行衍生化并清洗，加入胰蛋白酶降解處理后，得到多肽混合物；

將獲得的多肽溶解后，對N-糖肽和O-糖肽進行分離。

進一步的，將糖蛋白偶聯到固相樹脂上的方法包括如下步驟：

將糖蛋白溶解在0.3～2.0mL的緩沖液A中，加入醛基樹脂并在室溫下混合2-6小時；

添加10-30μl 1M NaCNBH₃后繼續混合2-6小時；

用300-600μl緩沖液B沖洗兩次并進行烷基化處理。

進一步的，所述烷基化處理的方法包括如下步驟：

用含有5～15mM DTT，2-10M尿素，0.5-2M碳酸氫銨的溶液進行還原處理；