[發(fā)明專利]一種基于固相法分離N-糖肽和O-糖肽的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202011481041.9 | 申請日： | 2020-12-15 |
| 公開（公告）號： | CN112578061A | 公開（公告）日： | 2021-03-30 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 楊霜;李舒?zhèn)?/a> | 申請（專利權(quán)）人： | 南京譜利健生物技術(shù)有限公司 |
| 主分類號： | G01N30/08 | 分類號： | G01N30/08;G01N30/88 |
| 代理公司： | 上海浙晟知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31345 | 代理人： | 楊小雙 |
| 地址： | 211500 江蘇省南京市棲霞區(qū)*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 基于 固相法 分離 糖肽 方法 | ||
1.一種基于固相法分離N-糖肽和O-糖肽的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：
將糖蛋白偶聯(lián)到固相樹脂上；
通過衍生化試劑對固相在樹脂上的糖蛋白唾液酸進(jìn)行衍生化并清洗，加入胰蛋白酶降解處理后，得到多肽混合物；
將獲得的多肽溶解后，對N-糖肽和O-糖肽進(jìn)行分離。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于固相法分離N-糖肽和O-糖肽的方法，其特征在于：將糖蛋白偶聯(lián)到固相樹脂上的方法包括如下步驟：
將糖蛋白溶解在0.3～2.0mL的緩沖液A中，加入醛基樹脂并在室溫下混合2-6小時(shí)；
添加10-30μl 1M NaCNBH3后繼續(xù)混合2-6小時(shí)；
用300-600μl緩沖液B沖洗兩次并進(jìn)行烷基化處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于固相法分離N-糖肽和O-糖肽的方法，其特征在于：所述烷基化處理的方法包括如下步驟：
用含有5～15mM DTT，2-10M尿素，0.5-2M碳酸氫銨的溶液進(jìn)行還原處理；
加入10～20mM的碘乙酰胺并在20～50℃和避光環(huán)境中振蕩0.5～2.0個(gè)小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種基于固相法分離N-多糖和O-糖肽的方法，其特征在于：通過衍生化試劑對固定在樹脂上的糖蛋白唾液酸進(jìn)行衍生化并清洗的具體步驟為：
采用200～300mM 1-羥基苯并三唑水合物和200～300mM EDC.HCl(N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的乙醇溶液，在37℃恒溫下與固定在樹脂上的糖蛋白唾液酸反應(yīng)1小時(shí)，分別用100％乙醇，1M NaCl和HPLC純凈水將樣品洗滌三次。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種基于固相法分離N-多糖和O-糖肽的方法，其特征在于：在對固定在樹脂上的糖蛋白唾液酸進(jìn)行衍生化并清洗后，加入胰蛋白酶降解處理后去除溶劑，得到多肽的方法包括如下步驟：
用1M氯化鈉，10％乙腈溶液沖洗后，加入胰蛋白酶在堿性環(huán)境下通過100mM碳酸氫銨和1M尿素溶液的降解固相化的糖蛋白；
收集產(chǎn)生的多肽后，采用親水色譜柱對糖肽進(jìn)行富集并用乙腈的水溶液清洗；
用離心干燥儀除去溶劑；
其中，糖肽包括N-糖肽和O-糖肽的混合物；乙腈的水溶液包括40％乙腈喝60％水。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種基于固相法分離N-糖肽和O-糖肽的方法，其特征在于：將獲得的多肽溶解后，對N-糖肽和O-糖肽進(jìn)行分離的方法包括如下步驟：
將多肽溶解在300-500μl緩沖液C中與樹脂混合后振蕩1小時(shí)，然后在600～1200rpm離心1-5min，收集上層清液；
用300-800μl的緩沖液B中對樹脂進(jìn)行了二次重洗；
將洗脫液匯集，并用反相C18純化，用離心干燥儀除去溶劑并重新溶解在50μl的0.2％甲酸溶液中，獲得N-糖肽；
分別用1M NaCl 500μl、10％乙腈溶液500μl和純水500μl對樹脂進(jìn)行洗滌；
將400-500μl含有100單位的O-糖肽切割酶的20mM NH4HCO3溶液和樹脂混合后在37℃振蕩8-15小時(shí)后，離心取上層清液；
用200-400μl 10％乙腈溶液清洗2-4次，并洗脫液收集在一起；
用離心干燥儀除去洗脫液中的溶劑，重新溶解在0.2％的甲酸溶液，獲得O-糖肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種基于固相法分離N-多糖和O-糖肽的方法，其特征在于：
所述緩沖液A包括10mM檸檬酸鈉，50mM碳酸鈉，其pH＝10；
所述緩沖液B包括50mM的PBS，其pH＝7.4；
所述緩沖液C包括50mM的NH4HCO3溶液,其pH＝8.0。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種基于固相法分離N-糖肽和O-糖肽的方法，其特征在于：所述固相樹脂為親水性固體材料，包括硅膠、瓊脂糖和表面包被親水性基團(tuán)的磁珠中的一種或多種組合。
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