[發(fā)明專利]單克隆抗體制備方法及采用該方法制得的抗體

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011480661.0
• 申請(qǐng)日: 2020-12-15
• 公開（公告）號(hào): CN112592407A
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏玉龍;吳炯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州恒康生命科學(xué)有限公司
• 主分類號(hào): C07K16/28
• 分類號(hào): C07K16/28;C12N15/85;G01N15/14
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• 代理人: 暫無信息

本申請(qǐng)涉及抗體的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及單克隆抗體制備方法及采用該方法制得的抗體；單克隆抗體制備方法，包括以下步驟：獲取抗原蛋白的編碼核苷酸序列并優(yōu)化密碼子，基于優(yōu)化了密碼子的抗原蛋白編碼核苷酸序列合成抗原基因A；將合成的抗原基因A插入載體pcDNA3.1中，制備出重組質(zhì)粒pcDNA3.1?Ag；將所述重組質(zhì)粒pcDNA3.1?Ag注射入動(dòng)物體內(nèi)，進(jìn)行基因免疫；取經(jīng)基因免疫的動(dòng)物的脾細(xì)胞并與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，之后在培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)，得到雜交瘤細(xì)胞；取雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，得到雜交瘤細(xì)胞的陽(yáng)性克隆，進(jìn)而得到抗體。單克隆抗體，使用上述單克隆抗體制備方法制得。本申請(qǐng)的制備方法能夠減少抗體制備的成本，降低雜交瘤細(xì)胞陽(yáng)性克隆的篩選難度，提高制備效率。

技術(shù)領(lǐng)域

本申請(qǐng)涉及抗體的技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種單克隆抗體制備方法及采用該方法制得的抗體。

背景技術(shù)

單克隆抗體是人工制備的雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)的。雜交瘤細(xì)胞是由一個(gè)經(jīng)抗原激活后的B淋巴細(xì)胞與一個(gè)骨髓瘤細(xì)胞融合形成。單克隆抗體具有純度高、特異性強(qiáng)、靈敏度高、交叉反應(yīng)少以及制備成本低等優(yōu)點(diǎn)。

目前，相關(guān)技術(shù)中，單克隆抗體的制備方法為：首先通過直接購(gòu)買或是實(shí)驗(yàn)室自己表達(dá)的方式得到蛋白抗原。之后用抗原對(duì)選取的動(dòng)物（一般為Balb/c小鼠）進(jìn)行免疫注射；抗原通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進(jìn)入動(dòng)物的外周免疫器官，刺激相應(yīng)B淋巴細(xì)胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏B淋巴細(xì)胞。之后由脾臟取小鼠B淋巴細(xì)胞與同系骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合得到雜交瘤細(xì)胞；之后對(duì)雜交瘤細(xì)胞采用ELISA法篩選而得到雜交瘤細(xì)胞的陽(yáng)性克隆，進(jìn)而通過擴(kuò)增得到足額的目標(biāo)抗體。

針對(duì)上述中的相關(guān)技術(shù)，發(fā)明人認(rèn)為采用直接購(gòu)買或是實(shí)驗(yàn)室表達(dá)的蛋白抗原存在成本高、使雜交瘤細(xì)胞篩選難度增加的問題。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)相關(guān)技術(shù)存在的不足，為了減少抗體制備的成本和雜交瘤細(xì)胞陽(yáng)性克隆的篩選難度，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N單克隆抗體制備方法及采用該方法制得的抗體。

第一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┑囊环N單克隆抗體制備方法，采用如下技術(shù)方案：

單克隆抗體制備方法，包括以下步驟：

獲取抗原蛋白的編碼核苷酸序列并優(yōu)化密碼子，基于優(yōu)化了密碼子的抗原蛋白編碼核苷酸序列合成抗原基因A；

將合成的抗原基因A插入載體pcDNA3.1中，制備出重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Ag；

將所述重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Ag注射入動(dòng)物體內(nèi)，進(jìn)行基因免疫；

取經(jīng)基因免疫的動(dòng)物的脾細(xì)胞并與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，之后在培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)，得到雜交瘤細(xì)胞；

取雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，得到雜交瘤細(xì)胞的陽(yáng)性克隆，進(jìn)而得到抗體。

通過采用上述技術(shù)方案，利用重組質(zhì)粒方便儲(chǔ)存和運(yùn)輸、構(gòu)建簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的特點(diǎn)，使抗體制備過程更加方便，制備成本更低。同時(shí)由于構(gòu)建只含抗原（Ag）基因，而不含任何標(biāo)簽分子基因的質(zhì)粒進(jìn)行基因免疫，產(chǎn)生的抗體只針對(duì)設(shè)計(jì)的抗原本身，結(jié)果幾乎不會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性干擾，很大程度降低了雜交瘤細(xì)胞的篩選難度。而且由于Ag蛋白的基因序列獲取非常容易，再通過人工合成基因并構(gòu)建質(zhì)粒載體，再直接免疫動(dòng)物，質(zhì)粒在動(dòng)物肌肉或者皮膚細(xì)胞中表達(dá)，蛋白經(jīng)過折疊和修飾后與天然蛋白的構(gòu)象沒有明顯差異，產(chǎn)生的抗體與天然抗原的親和力相比于蛋白抗原更高。

可選的，所述雜交瘤細(xì)胞的篩選方法具體為：

基于所述優(yōu)化了密碼子的抗原蛋白編碼核苷酸序列，構(gòu)建重組慢病毒載體質(zhì)粒pLenti-Ag-EGFP；

將所述重組慢病毒載體質(zhì)粒pLenti-Ag-EGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞；培養(yǎng)細(xì)胞，收集富含慢病毒的細(xì)胞上清液并濃縮，得到濃縮慢性病毒；

采用所述濃縮慢病毒感染骨髓瘤細(xì)胞，得到穩(wěn)定表達(dá)Ag的骨髓瘤細(xì)胞；

將所述穩(wěn)定表達(dá)Ag的骨髓瘤細(xì)胞與原骨髓瘤細(xì)胞復(fù)配，之后加入所述雜交瘤細(xì)胞的上清液得到混合體系，冰上孵育；