[發明專利]單克隆抗體制備方法及采用該方法制得的抗體

在審

• 申請號: 202011480661.0
• 申請日: 2020-12-15
• 公開（公告）號: CN112592407A
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發明（設計）人: 夏玉龍;吳炯
• 申請（專利權）人: 蘇州恒康生命科學有限公司
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C12N15/85;G01N15/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.單克隆抗體制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

獲取抗原蛋白的編碼核苷酸序列并優化密碼子，基于優化了密碼子的抗原蛋白編碼核苷酸序列合成抗原基因A；

將合成的抗原基因A插入載體pcDNA3.1中，制備出重組質粒pcDNA3.1-Ag；

將所述重組質粒pcDNA3.1-Ag注射入動物體內，進行基因免疫；

取經基因免疫的動物的脾細胞并與骨髓瘤細胞進行細胞融合，之后在培養基上選擇培養，得到雜交瘤細胞；

取雜交瘤細胞進行篩選，得到雜交瘤細胞的陽性克隆，進而得到抗體。

2.根據權利要求1所述的單克隆抗體制備方法，其特征在于：所述雜交瘤細胞的篩選方法具體為：

基于所述優化了密碼子的抗原蛋白編碼核苷酸序列，構建重組慢病毒載體質粒pLenti-Ag-EGFP；

將所述重組慢病毒載體質粒pLenti-Ag-EGFP轉染細胞；培養細胞，收集富含慢病毒的細胞上清液并濃縮，得到濃縮慢性病毒；

采用所述濃縮慢病毒感染骨髓瘤細胞，得到穩定表達Ag的骨髓瘤細胞；

將所述穩定表達Ag的骨髓瘤細胞與原骨髓瘤細胞復配，之后加入所述雜交瘤細胞的上清液得到混合體系，冰上孵育；

之后向所述混合體系加入山羊抗小鼠IgG-PE并冰上孵育；

采用流式細胞儀檢測經冰上孵育后的混合體系，篩選出檢測結果為顯示兩個細胞亞群，且其中一亞群的細胞為EGFP和PE雙陽性，另一亞群的細胞為EGFP和PE雙陰性的體系，得到雜交瘤細胞的陽性克隆。

3.根據權利要求1或2所述的單克隆抗體制備方法，其特征在于：通過NCBI網站獲取所述抗原蛋白的編碼核苷酸序列；通過軟件或工具網站優化密碼子。

4. 根據權利要求3所述的單克隆抗體制備方法，其特征在于：合成抗原基因A之前，先對所述密碼子優化后的抗原蛋白編碼核苷酸序列進行設計；在所述抗原蛋白編碼核苷酸序列的5’端添加Xho I限制性酶切位點和克扎克序列，在所述抗原蛋白編碼核苷酸序列的3’端添加終止密碼子以及EcoR I限制性酶切位點。

5.根據權利要求4所述的單克隆抗體制備方法，其特征在于：所述重組質粒pcDNA3.1-Ag的制備方法如下：

取抗原基因A，加入限制性內切酶Xho I、限制性內切酶EcoR I以及反應緩沖液，反應得到基因酶切產物；取pcDNA3.1質粒、限制性內切酶Xho I、限制性內切酶EcoR I以及反應緩沖液，反應得到載體酶切產物；

取所述基因酶切產物和載體酶切產物并加入T4 DNA連接酶和T4緩沖液混合，之后在不高于38℃的溫度下反應，使基因酶切產物和載體酶切產物連接；

將連接產物導入感受態細胞進行轉化，之后質粒抽提得到重組質粒pcDNA3.1-Ag。

6.根據權利要求1或2所述的單克隆抗體制備方法，其特征在于：所述重組質粒pcDNA3.1-Ag注射入動物體內進行基因免疫的具體方法為：

準備Balb/c小鼠，肌肉注射pcDNA3.1-Tim-1重組質粒；

利用電轉法將pcDNA3.1-Tim-1重組質粒轉入小鼠細胞中；

每隔2-4周免疫一次；抗體滴度高于1:10000后加強免疫一次。

7.根據權利要求6所述的單克隆抗體制備方法，其特征在于：所述雜交瘤細胞具體制備方法如下：

取經過基因免疫的小鼠的脾細胞，并將其與SP2/0細胞混合得到混合細胞，所述SP2/0與脾細胞的個數比為1：5-10，充分混勻，離心，棄上清液；

混合細胞中加入PEG4000以及緩沖液，離心，棄上清液；之后與含小牛血清的HAT培養基混合，之后分散至預先制備的孔板中，進行細胞融合得到雜交瘤細胞。