[發(fā)明專(zhuān)利]西柏烷二萜的微生物生產(chǎn)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011479981.4
• 申請(qǐng)日: 2020-12-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112626132B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-08-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張洪博;張宇;劉曉峰;劉艷華;杜詠梅;張忠鋒
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/81
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/81;C12P7/02;C12R1/865
• 代理公司: 青島中天匯智知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37241
• 代理人: 袁曉玲

本發(fā)明屬于生物合成技術(shù)領(lǐng)域。針對(duì)現(xiàn)有的西柏烷二萜化學(xué)合成方法工藝復(fù)雜、污染環(huán)境，煙草直接提取資源有限、產(chǎn)率低，以及共同存在的目標(biāo)產(chǎn)物得率低、成本高等問(wèn)題，本發(fā)明提供一種西柏烷二萜的微生物生產(chǎn)方法，通過(guò)構(gòu)建兩種關(guān)鍵酶基因的酵母表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中，通過(guò)發(fā)酵提取，最終獲得西柏烷二萜。本發(fā)明有效地避免了化學(xué)合成工藝復(fù)雜、污染環(huán)境、目標(biāo)產(chǎn)物得率低，以及直接從植物中提取西柏烷二萜效率低，純化步驟繁瑣，需要消耗大量的人力物力等問(wèn)題。本發(fā)明具有專(zhuān)一性強(qiáng)、生長(zhǎng)周期短、反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物合成技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種西柏烷二萜的微生物生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)

西柏烷是在自然界中廣泛存在的一類(lèi)天然二萜化合物，首次報(bào)道的西柏烷類(lèi)化合物是在松樹(shù)樹(shù)干分泌的樹(shù)脂中發(fā)現(xiàn)的。煙草是西柏烷含量最豐富的陸生植物，西柏烷二萜主要分布于煙草植物葉片表面腺毛以及煙花分泌物中。煙草中最主要的兩種西柏烷二萜是西柏三烯一醇和西柏三烯二醇，這兩種西柏烷二萜有α-和β-兩種異構(gòu)體。西柏烷二萜類(lèi)具有抗菌、抗癌、抗炎、神經(jīng)保護(hù)等一系列生物活性，使其在食品、化妝品、保健品、植物源農(nóng)藥制劑以及醫(yī)藥領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

西柏烷二萜在植物體內(nèi)的含量并不高，直接從植物中提取西柏烷二萜效率低，純化步驟繁瑣，需要消耗大量的人力物力，也只能提取到西柏烷二萜粗提樣品。而化學(xué)合成西柏烷二萜具有合成工藝復(fù)雜、成本高、毒性大、產(chǎn)率低等缺陷，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有的西柏烷二萜化學(xué)合成方法工藝復(fù)雜、污染環(huán)境，煙草直接提取資源有限、產(chǎn)率低，以及共同存在的目標(biāo)產(chǎn)物得率低、成本高等問(wèn)題，本發(fā)明提供一種西柏烷二萜的微生物生產(chǎn)方法，通過(guò)構(gòu)建兩種關(guān)鍵酶基因的酵母表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中，通過(guò)發(fā)酵提取，最終獲得西柏烷二萜。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

西柏烷二萜的微生物生產(chǎn)方法，包括以下步驟：

(1)微生物表達(dá)載體構(gòu)建：以含有西柏烷合成酶基因CBTS1的pUC18-Cemb2-1質(zhì)粒為模板，利用特異性引物通過(guò)PCR擴(kuò)增出CBTS1片段，將擴(kuò)增出的CBTS1基因片段和通過(guò)分子修飾添加了翻譯引導(dǎo)肽(GD)的pGAD載體分別用限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切2h，回收純化的載體和片段，通過(guò)酶切鏈接以及轉(zhuǎn)化DH5α獲得微生物表達(dá)載體；

或者，以含有細(xì)胞色素加氧酶CYP450基因的pUC18-Cemb2質(zhì)粒為模板，利用特異性引物通過(guò)PCR擴(kuò)增出CYP450片段，將擴(kuò)增出的CYP450基因片段和通過(guò)分子修飾添加了翻譯引導(dǎo)肽(GD)的pGBK載體分別用限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切2h，回收純化的載體和片段，通過(guò)酶切鏈接以及轉(zhuǎn)化DH5α獲得微生物表達(dá)載體；

(2)宿主菌株的選擇：選用GGPP(牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸)產(chǎn)量較高的BY-T20釀酒酵母，其基因型為：

BY-T20(MATα-trp1Δ0-leu2Δ0-ura3Δ0,trp1::HIS3-P_PGK1-BTS1/ERG20-T_ADH1-P_TDH3-SaGGPS-T_TPI1-P_TEF1-tHMG1-T_CYC1)；

(3)制備微生物感受態(tài)：挑取釀酒酵母BY-T20單菌于YPDA培養(yǎng)基活化并逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，得到純而壯的種子，離心、收集菌體于離心管中，用ddH₂O洗滌，離心，最后用1×TE/LiAc重懸菌落；

(4)外源基因共轉(zhuǎn)化微生物感受態(tài)：采用LiAc/PEG carrier DNA多質(zhì)粒轉(zhuǎn)化法將帶有CBTS1基因的載體以及帶有CYP450基因的載體以不同組合形式，分別共轉(zhuǎn)化到氨基酸缺陷型微生物菌株中，轉(zhuǎn)化后將菌液涂布在營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基SD/-Leu/-Trp上，30℃培養(yǎng)2-3d，獲得重組微生物菌株；