[發明專利]西柏烷二萜的微生物生產方法

有效

• 申請號: 202011479981.4
• 申請日: 2020-12-15
• 公開（公告）號: CN112626132B
• 公開（公告）日: 2022-08-26
• 發明（設計）人: 張洪博;張宇;劉曉峰;劉艷華;杜詠梅;張忠鋒
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院煙草研究所
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12P7/02;C12R1/865
• 代理公司: 青島中天匯智知識產權代理有限公司 37241
• 代理人: 袁曉玲

1.西柏烷二萜的微生物生產方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）微生物表達載體構建：以含有西柏烷合成酶基因CBTS1的pUC18-Cemb2-1質粒為模板，利用特異性引物通過PCR擴增出CBTS1片段，將擴增出的CBTS1基因片段和通過分子修飾添加了翻譯引導肽GD的pGAD載體分別用限制性核酸內切酶進行雙酶切2h，回收純化的載體和片段，通過酶切鏈接以及轉化DH5α獲得微生物表達載體；

或者，以含有細胞色素加氧酶CYP450基因的pUC18-Cemb2質粒為模板，利用特異性引物通過PCR擴增出CYP450片段，將擴增出的CYP450基因片段和通過分子修飾添加了翻譯引導肽GD的pGBK載體分別用限制性核酸內切酶進行雙酶切2h，回收純化的載體和片段，通過酶切鏈接以及轉化DH5α獲得微生物表達載體；

所述引導肽的編碼序列為SEQ ID NO：1所示；所述西柏烷合成酶基因CBTS1序列為SEQID NO：2所示；所述細胞色素加氧酶CYP450基因序列為SEQ ID NO：3所示；

（2）宿主菌株選擇：選用BY-T20釀酒酵母做為西柏烷合成酶表達載體的宿主菌；

（3）制備微生物感受態：挑取釀酒酵母BY-T20單菌于YPDA培養基活化并逐級擴大培養，得到純而壯的種子，離心、收集菌體于離心管中，用ddH₂O洗滌，離心，最后用1×TE/LiAc重懸菌落；

（4）外源基因共轉化微生物感受態：采用 LiAc/PEG carrier DNA 多質粒轉化法將帶有CBTS1基因的載體以及帶有CYP450基因的載體，分別共轉化到氨基酸缺陷型微生物菌株中，轉化后將菌液涂布在營養缺陷培養基SD/-Leu/-Trp上，30℃培養 2-3d，獲得重組微生物菌株；

（5）重組微生物菌株發酵：挑取重組菌株單菌落接種于SD/-Trp/-Leu營養缺陷液體培養基中，先用30℃，220 r/min預培養48h作為種子液，將種子液按照5％的比例接種于YPDA液體培養基進行搖瓶發酵，在30℃，220 r/min條件下培養72h；

（6）微生物工程菌產物提取：搖瓶發酵結束后，將發酵液離心，分離上清發酵液和菌體；上清發酵液用等體積的乙酸乙酯充分萃取，離心，吸取上層有機相，根據需要可多次萃取，合并提取物；利用液氮將離心后的菌體進行研磨，研磨粉末溶于20mL ddH₂O中，采用超聲波細胞破碎儀將酵母充分破壁20min，再加入等體積的乙酸乙酯萃取，靜置30min，離心，吸取上層有機相；采用旋轉蒸發儀分別從上清液和菌體提取物中蒸餾出乙酸乙酯，得到目標產物。

2.根據權利要求1所述的西柏烷二萜的微生物生產方法，其特征在于，所述步驟（3）挑取釀酒酵母BY-T20單菌落于5mL YPDA培養基中，220rpm/30℃過夜，將搖好的菌液加入到50mL YPDA培養基中，220rpm/30℃搖6h；3000rpm離心5min，收集菌體于1.5mL離心管中，用1mL ddH₂O洗滌2次，3000rpm/5min離心，最后用1mL 1×TE/LiAc重懸菌落。

3.根據權利要求1所述的西柏烷二萜的微生物生產方法，其特征在于，所述步驟（6）微生物工程菌產物提取：上清發酵液用等體積的乙酸乙酯，30℃，220r/min充分萃取30min，離心，吸取上層有機相，抽提2次，合并提取物。