[發(fā)明專利]檢測(cè)EB病毒/HCMV的試劑盒及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011479279.8
• 申請(qǐng)日: 2020-12-15
• 公開（公告）號(hào): CN112415205A
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉為勇;張祺;劉芳;劉映樂;屈三甫;梅益
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/58
• 分類號(hào): G01N33/58;G01N33/569
• 代理公司: 武漢科皓知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

本發(fā)明提供了一種針對(duì)EB病毒、HCMV的核酸適配體檢測(cè)試劑盒，還提供了試劑盒的制備方法和應(yīng)用。此試劑盒檢測(cè)時(shí)具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)迅速、準(zhǔn)確性高和靈敏度高的特點(diǎn)，可結(jié)合酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡等檢測(cè)裝置，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)于兩種病毒的精確檢測(cè)。試劑盒靈敏度較高、特異性好、測(cè)量范圍寬、操作簡(jiǎn)單、可以同時(shí)檢測(cè)兩種病毒、有著良好的市場(chǎng)前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本申請(qǐng)涉及生物體外檢測(cè)，具體地說，本發(fā)明涉及同時(shí)檢測(cè)EB病毒/HCMV的試劑盒，制備試劑盒的方法，以及試劑盒在同時(shí)檢測(cè)EB病毒、HCMV樣本中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是皰疹病毒科，嗜淋巴細(xì)胞病毒屬的一種病毒，是一種DNA病毒。EB病毒具有在體內(nèi)外專一性地感染人類及某些靈長(zhǎng)類B細(xì)胞的生物學(xué)特性。人類是EB病毒感染的主要宿主，主要通過唾液進(jìn)行傳播，無癥狀感染主要發(fā)生在幼兒時(shí)期，據(jù)調(diào)查顯示3～5歲幼兒90％以上曾感染EB病毒，90％以上的成人都有病毒抗體。EB病毒是傳染性單核細(xì)胞增多癥的病原體，此外EB病毒與鼻咽癌、兒童淋巴瘤的發(fā)生有密切相關(guān)性，被列為可能致癌的人類腫瘤病毒之一。目前可以通過EB病毒抗體進(jìn)行病毒檢測(cè)，主要有針對(duì)病毒的衣殼抗原(CA)、早期抗原(EA)和核抗原(EBNA)。

巨細(xì)胞病毒(Cytomegalovirus)，又稱為細(xì)胞包涵體病毒，是皰疹病毒科的一種病毒，是一種DNA病毒。感染巨細(xì)胞病毒的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生腫大，并具有巨大的核內(nèi)包涵體。巨細(xì)胞病毒對(duì)宿主或者培養(yǎng)的細(xì)胞有高度的種特異性。人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是皰疹病毒家族中基因組最大的成員。巨細(xì)胞病毒分布廣泛，其他動(dòng)物皆可遭受感染，引起以生殖泌尿系統(tǒng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟疾患為主的各系統(tǒng)感染，從輕微無癥狀感染直到嚴(yán)重缺陷或死亡。CMV在人群中感染非常廣泛，中國成人感染率達(dá)95％以上，通常呈隱性感染，多數(shù)感染者無臨床癥狀，但在一定條件下侵襲多個(gè)器官和系統(tǒng)可產(chǎn)生嚴(yán)重疾病。HCMV感染的實(shí)驗(yàn)室診斷依賴于：①檢測(cè)感染組織中HCMV細(xì)胞病理學(xué)、抗原或DNA；②檢測(cè)體液中病毒DNA或抗原；③血清學(xué)轉(zhuǎn)換驗(yàn)證；④分離來自組織或分泌物中的病毒。

對(duì)于EB病毒、HCMV的樣品檢測(cè)在臨床檢測(cè)以及實(shí)驗(yàn)研究中十分重要。現(xiàn)有的技術(shù)中對(duì)于病毒感染或者病毒蛋白的檢測(cè)多采用特異性的抗體進(jìn)行識(shí)別，制備比較復(fù)雜，步驟比較繁瑣，成本較高，在大規(guī)模推廣中有一定的缺陷。核酸適配體是一段單鏈核酸(一般大小在20～60個(gè)堿基左右)，能通過折疊形成特定的三維結(jié)構(gòu)并與相對(duì)應(yīng)的靶分子進(jìn)行高親和力、高特異性的結(jié)合。核酸適配體可以通過模擬自然進(jìn)化過程的人工篩選技術(shù)-指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)篩選得到，是一種具有識(shí)別功能的新型核酸分子。利用SELEX技術(shù)可以從隨機(jī)單鏈核酸序列庫中篩選出特異性的與靶物質(zhì)高度親和的核酸適配體，該技術(shù)已經(jīng)成功的運(yùn)用于許多靶物質(zhì)的篩選，包括金屬離子、有機(jī)染料、藥物、蛋白質(zhì)、氨基酸以及各種細(xì)胞因子等。該技術(shù)具有庫容量大、適應(yīng)范圍廣泛、分辨率高、親和力高，篩選過程相對(duì)簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)，實(shí)用性高等特點(diǎn)。適配體對(duì)應(yīng)靶標(biāo)物質(zhì)的高特異性和高親和性的特點(diǎn)與抗體的功能類似，但是適配子的靶標(biāo)范圍更加的廣泛，可以很好地運(yùn)用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)、診斷和治療等多個(gè)方面。

核酸適配體具有特異性和高親和力的原因是單鏈核酸在遇到靶標(biāo)分子時(shí)可以形成例如口袋、發(fā)卡、G-四聚體等獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)在結(jié)合靶標(biāo)分子時(shí)的原理與抗體特異性識(shí)別相應(yīng)抗原決定簇的原理類似，例如通過氫鍵、疏水結(jié)構(gòu)、離子鍵等與靶標(biāo)分子特異性的結(jié)合。基于適配體具有較高特異性地識(shí)別病原微生物或者病變細(xì)胞的生物學(xué)特性，核酸適配體能被廣泛的應(yīng)用于檢測(cè)技術(shù)以及生物傳感器的構(gòu)建，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)于病原體或者疾病的精準(zhǔn)診斷。