[發(fā)明專利]精子質(zhì)膜保護(hù)劑HEPES/BSA及染色液和染色方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011476061.7
• 申請日: 2020-12-14
• 公開（公告）號: CN112649268A
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曾長軍;王藝涵;鄧思維;王文燦
• 申請（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 趙浩竹

本發(fā)明公開了一種用于精子活率檢測的精子質(zhì)膜保護(hù)劑HEPES/BSA及染色液和染色方法，該保護(hù)劑HEPES/BSA包含：4?羥乙基哌嗪乙磺酸、牛血清白蛋白、D?果糖、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂和水；其中，所述4?羥乙基哌嗪乙磺酸、牛血清白蛋白、D?果糖、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣和氯化鎂的濃度分別為10mmol·L^?1、1g·L^?1、14mmol·L^?1、130mmol·L^?1、4mmol·L^?1、1mmol·L^?1、0.5mmol·L^?1。本發(fā)明的精子質(zhì)膜保護(hù)劑HEPES/BSA及其染色液不僅能夠提高精子活率檢測結(jié)果準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，而且能夠有效減少精子凝聚成團(tuán)、減緩抹片干燥速度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于精子活率檢測的染色液，具體涉及一種精子質(zhì)膜保護(hù)劑HEPES/BSA及染色液和染色方法。

背景技術(shù)

精子質(zhì)膜完整性是維持精子正常生理功能的基礎(chǔ)。通常認(rèn)為，細(xì)胞膜喪失完整性，即可認(rèn)為細(xì)胞已經(jīng)死亡。因此，精子膜的完整性常作為評價精子活率的基本指標(biāo)。非熒光染料染色是目前判斷精子質(zhì)膜完整性最簡便的方法之一。目前，國際上主要采用的精子活率檢測方法——非熒光染料染色法的基本原理是：細(xì)胞損傷或死亡時，染液可穿透細(xì)胞膜，與DNA結(jié)合，使其著色。而活細(xì)胞能阻止染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，故可以通過顯微鏡觀察鑒別死細(xì)胞與活細(xì)胞。死精子質(zhì)膜喪失選擇通透性功能，從而使染料可透過質(zhì)膜進(jìn)入精子，而活精子拒染。

目前，生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)室最常使用的非熒光染料有：0.4％臺盼藍(lán)、0.5％伊紅、0.67％伊紅+10％苯胺黑(WHO人精子活率檢測標(biāo)準(zhǔn)方法)。0.5％伊紅作為國際常用檢測精子活率的染料，使用設(shè)備簡單，但操作比較繁瑣，且對精子有毒害作用，易高估死精子比例，誤差較大。另外，伊紅濃度越大、染色時間越長，精子聚集成團(tuán)的現(xiàn)象越明顯，且不易辨別精子形態(tài)和染色情況。0.67％伊紅+10％苯胺黑是在伊紅染色法上的進(jìn)一步優(yōu)化，相比于伊紅，能夠有效避免精子聚集現(xiàn)象，但該方法依然存在著易高估死亡精子的問題。0.4％臺盼藍(lán)染色過程迅速，可在幾分鐘內(nèi)對細(xì)胞進(jìn)行染色分析。但是，臺盼藍(lán)染液濃度和染色時間對檢測結(jié)果具有較大影響，精子容易凝聚成團(tuán)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種精子質(zhì)膜保護(hù)劑HEPES/BSA及染色液和染色方法，解決現(xiàn)有對精子活率檢測中存在凝聚成團(tuán)以及精子活率檢測準(zhǔn)確性和可靠性問題。該發(fā)明不僅能夠提高精子活率檢測結(jié)果準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，而且能夠有效減少精子凝聚成團(tuán)、減緩抹片干燥速度，易于操作。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種精子質(zhì)膜保護(hù)劑HEPES/BSA，該保護(hù)劑HEPES/BSA包含：4-羥乙基哌嗪乙磺酸、牛血清白蛋白、D-果糖、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂和水；其中，所述4-羥乙基哌嗪乙磺酸、牛血清白蛋白、D-果糖、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣和氯化鎂的濃度分別為10mmol·L^-1、1g·L^-1、14mmol·L^-1、130mmol·L^-1、4mmol·L^-1、1mmol·L^-1、0.5mmol·L^-1。

本發(fā)明的保護(hù)劑中Hepes及BSA能維持溶液pH值，保護(hù)精子質(zhì)膜完整性。D-果糖為精子提供能量；氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣和氯化鎂主要維持溶液的離子平衡。

本發(fā)明的另一目的是提供一種穩(wěn)定高效檢測精子活率的染色液，該染色液包含：臺盼藍(lán)、PBS緩沖液和所述的精子質(zhì)膜保護(hù)劑HEPES/BSA；其中，所述臺盼藍(lán)的濃度為0.4～0.8％。

優(yōu)選地，所述臺盼藍(lán)和HEPES/BSA保護(hù)液用量比為1～2g：125mL。

本發(fā)明的另一目的是提供一種穩(wěn)定高效檢測精子活率的方法，該方法采用所述的染色液對待檢測的精子樣品進(jìn)行染色。