[發(fā)明專利]一種抑制HIS1基因表達(dá)的RNAi植物表達(dá)載體及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011475241.3
• 申請(qǐng)日: 2020-12-14
• 公開（公告）號(hào): CN112575028A
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 歐陽超;林師;趙惠敏;陳思蘭;陳欣妍;安保光;曾翔;吳永忠;黃培勁
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 海南波蓮水稻基因科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/84
• 分類號(hào): C12N15/84;C12N15/66;C12N15/65;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 陳征

本發(fā)明提供了一種抑制HIS1基因表達(dá)的RNAi植物表達(dá)載體及其應(yīng)用，以及一種干擾植物HIS1表達(dá)的方法和獲得對(duì)β?三酮類除草劑顯性敏感植物的方法。將本發(fā)明的RNAi植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻，能夠成功抑制基因HIS1的表達(dá)，并將水稻從對(duì)除草劑具有抗性轉(zhuǎn)變?yōu)槊舾校沟妹舾兄仓昕梢酝ㄟ^施用除草劑的方式被清除，從而培育了一種對(duì)除草劑顯性敏感的水稻。該水稻在培育轉(zhuǎn)基因新品種，雜交水稻制種，防止轉(zhuǎn)基因逃逸等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抑制HPPD抑制劑敏感型1(HIS1)基因表達(dá)的植物表達(dá)載體和其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)在各種農(nóng)作物領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品需要加以嚴(yán)格的控制和監(jiān)管，防止轉(zhuǎn)基因漂移污染其他品種甚至其他物種就顯得尤為重要。因此，需要建立一種能夠定向清除雜交種子或轉(zhuǎn)基因植株的機(jī)制。培育獲得除草劑敏感的不育系或恢復(fù)系是解決問題的有效手段之一。

β-三酮類除草劑(b-Triketone herbicides,bTHs)是4-羥基苯丙酮酸雙加氧酶(HPPD)抑制劑，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，可有效地防除多種闊葉雜草和禾本科雜草。用于稻田中雜草控制的bTH雙環(huán)磺草酮(benzobicyclon,BBC)，對(duì)于可以對(duì)抗其他類型除草劑(包括磺酰脲)的稻雜草有明顯功效(Kraehmer,et al.Herbicides as Weed Control Agents:Stateof the Art:I.Weed Control Research and Safener Technology:The Path to ModernAgriculture.Plant Physiology(2014).)。因此，β-三酮類除草劑常用于清除稻田的大多數(shù)闊葉類雜草和禾本科雜草，而研究表明，水稻對(duì)BBC的抗性候選基因?yàn)镠IS1(HPPD抑制劑敏感型1)。HIS1編碼351個(gè)氨基酸的Fe(II)/2-酮戊二酸依賴型加氧酶蛋白，BBC敏感型品種的第Ⅳ外顯子缺失28bp，造成功能缺失(Maeda,Hideo,et al.A rice gene that confersbroad-spectrum resistance toβ-triketone herbicides.Science365.6451(2019):393-396.)。

若能培育出對(duì)β-三酮類除草劑顯性敏感的水稻，將會(huì)在培育轉(zhuǎn)基因新品種，雜交水稻制種，防止轉(zhuǎn)基因逃逸等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種能夠有效的影響HPPD抑制劑敏感型1基因(HIS1)表達(dá)的植物表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。

為達(dá)到以上目的，本發(fā)明提供了一種抑制HPPD抑制劑敏感型1基因HIS1表達(dá)的RNAi植物表達(dá)載體，含有發(fā)卡結(jié)構(gòu)表達(dá)盒，其中所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)表達(dá)盒含有由SEQ ID No.1-3所示的DNA片段所形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)。

其中，SEQ ID No.1所示的DNA片段為基于HIS1編碼框的長度為325bp的正向DNA片段，SEQ ID No.3所示的DNA片段為基于HIS1編碼框的長度為325bp的與SEQ ID No.1所示的DNA片段反向互補(bǔ)的DNA片段。SEQ ID No.2為來自水稻Zinc finger基因的內(nèi)含子序列(Rice intron)。

SEQ ID No.1至3所示的DNA片段按照從上游到下游的方向依次排列。該發(fā)夾表達(dá)盒可在轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄形成發(fā)卡式的二級(jí)結(jié)構(gòu)，SEQ ID No.2所示的DNA片段形成發(fā)卡的“環(huán)”，SEQ ID No.1和3所示的DNA片段互補(bǔ)形成發(fā)卡的“莖”。

其中，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)表達(dá)盒還包括位于發(fā)卡結(jié)構(gòu)上游的植物組成型啟動(dòng)子或植物組織特異性啟動(dòng)子，以及，位于發(fā)卡結(jié)構(gòu)下游的終止子。

其中所述植物組成型啟動(dòng)子為水稻或玉米的Ubi啟動(dòng)子、Rubisco小亞基啟動(dòng)子、Cab啟動(dòng)子、CAMV 35S啟動(dòng)子或Actin啟動(dòng)子。優(yōu)選的，當(dāng)啟動(dòng)子為水稻或玉米的Ubi啟動(dòng)子時(shí)，能夠取得非常強(qiáng)的干擾HIS1基因表達(dá)的效果。